4生物样品超薄切片技术.pptVIP

第三节 负染色技术 一负染色及其原理： 1.负染色：即阴性染色 利用高电子密度、并且在电镜下不显示结构的重金属 盐类在样品四周的堆积而增强样品外围的电子密度，从而衬托出样品的形态和大小。 载网和膜 样品 染色液 2.原理：电子束通过原子序数高的物质时，与其电子和原 子核碰撞的几率较高，容易发生散射而形成负反差。 任何物体若被密度比本身大2倍以上的物质所包围或 浸没时，电镜下反差得到加强而形成负反差。 * * 生物样品 常规制样技术 超薄切片技术 负染色技术 扫描样品制作技术 透射电镜 特殊制样技术 冷冻蚀刻技术 电镜细胞化学技术 免疫电镜技术 X射线微区分析技术 第四章 透射电镜生物样品 制备技术 第一节 载网和支持膜 第二节 超薄切片的制作 第三节 负染色技术 第一节 载网和支持膜 一、载网：用于承载样品的(直径为3mm)网状材料。 1.载网的类型及选择： 非金属网： 载网 金属网 铜网： 惰性网： 70％的透过率 2.载网的清洗：酸碱法或有机溶剂、蒸馏水等洗净干燥。 X射线元素分析 常规超薄切片(200目以上) 细胞化学 二、样品支持膜 为了增强样品的强度，在载网表面先覆一层薄膜。 1.对膜的要求： 本身没有结构，薄而透明，电子束易通过； 有足够的机械强度，经得住电子束的轰击； 不与样品发生化学反应。 厚度在10～15nm 2.常用支持膜及其制备 福尔莫瓦膜（Formvar): 化学名称：聚乙烯醇缩甲醛. 特点：机械强度高，制作简便. 制作：0.2～0.5％的氯仿溶液，玻璃片汆出,水面剥离法。 火棉胶膜：1~2%醋酸戊脂溶液，平皿沉淀法。 碳膜：稳定性好，高分辨制样。 操作方法 0.2~0.5%的 氯仿溶液 蒸馏水 膜 1.福尔莫瓦支持膜的制作方法 2.火棉胶膜用平皿水面展开法： 平皿中盛有双蒸馏水，滴两滴1~3%的火棉胶膜液， 待片刻溶剂挥发后，在膜上摆放洁净的铜网，滤纸捞起。 3.碳膜制作：用真空喷镀法制膜。 第二节 超薄切片的制作 超薄切片：是指厚度小于100 (50~70)纳米的切片。 要求：厚薄均匀、厚度符合标准； 无皱褶刀痕、震颤和沉淀； 细胞结构保存良好，具有良好的电子反差； 具有一定程度的机械强度。 制作流程：包括六大步，40多次操作 取材→固定→脱水→包埋→切片→染色→ 镜检 超薄切片制作流程图 0~4℃ 室温 2 3 2 37~60℃ 染色 观察 聚合 修块 切片 捞片 取材 固定 漂洗 50% 70% 80% 包埋 90% 95% 100% 过渡 浸透 一、取材 从动、植物机体上或细胞及微生物培养物中 获取所需要的研究材料的操作过程。 1.取材的原则要求：准、快、小、冷、轻五字原则。 准确：根据研究目的确定取材部位，取到典型部位。 快速：材料离体后应在1分钟内投入固定液。 体积小：固定液渗透力所限，样品体积为1mm3 或1×3mm长条。 低温：固定液及器材需预冷(0~4 ℃)，以降低自溶酶的活性。 防损伤：器械要锋利，切割轻巧，防挤压、牵拉损伤 组织细胞的内部结构。 取材 ↓ 固定 ↓ 脱水 ↓ 包埋 ↓ 切片 ↓ 染色 ↓ 镜检 2.取材方法： 动物材料的获取： 急性处死或麻醉后，在1～2分钟解剖出所需材料，切成 标准块立即投入固定液，低温(0～4℃)保存；特殊难 取的材料必须原位固定或灌流固定，再取材投入固定液。 植物材料的获取： 注意部位和方向性。 叶片切取1×3㎜长条；根、茎切取标准块；表面有毛刺的 材料先用酶处理使之软化，表面有蜡质的叶片先脱蜡， 蒸馏水洗净后再取材固定。 悬浮样品的获取： 加入适量固定液悬浮固定后，低速离心收集成团块再固定。 需抽气使样品沉底 保低温 野外取材： 携带冰壶保存固定液和材料，确保动物材料的现场固定； 植物材料可保湿带回实验室再取材固定。 取材 ↓ 固定 ↓ 脱水 ↓ 包埋 ↓ 切片 ↓ 染色 ↓ 镜检 二、固定 用化学或物理的方法迅速杀死细胞的过程 1.固定的目的： 在分子水平上真实地保存组织细胞生活 状态的细节，尽量减少细胞的死后变化。 2.固定的类型： 固定 物理固定法： 化学固定法： 3.固定液的作用： 迅速均匀渗透到细胞内部，稳定各种细胞成分； 破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶； 通过化学作用建立分子交联，形成细胞骨架； 提供一定的电子反差。 超低温快速冷冻固定法 使用化学试剂快速杀死细胞 取材 ↓ 固定 ↓ 脱