siRNA导入细胞的策略.docVIP

广州市锐博生物科技有限公司 GUANGZHOU RUIBO BIO CO., LTD www.siRNA.cn 　广州市经济技术开发区·广州科学城·广州国际企业孵化器 A区 A1007室（邮编：510663） Guangzhou Science Park, China.Tel: 8620 Fax:8620Web site: , email: order@, info@, design@ siRNA导入细胞的策略 siRNA导入哺乳动物细胞的策略 RNAi在哺乳动物细胞中通常用于阻断特定基因的表达从而研究基因的功能。成功的进行RNAi的问题在于使siRNA导入细胞，常见的做法是将靶向特定基因的大约21碱基长短的双链siRNAs(small interfering RNAs)，或者是45—50-mer的发夹结构RNA（small hairpin RNA, shRNA）转染到细胞。此外，通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特定基因的表达。 1.1 siRNA的转染 将一种特殊构建的ｓｉＲＮＡ—对称性 3′突出2nt的约 21nt (nucleotide)siRNAs双链复合物通过阳离子脂质体可以转入哺乳动物细胞中。 1.2 shRNA转染引入细胞 45—50-mer的发夹结构RNA（small hairpin RNA, shRNA）转染到细胞。shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA，从而引发基因沉默或者表达抑制。 1.3 胞内表达siRNA 　 体内载体合成siRNA,是最近迅速发展起来的新技术。它是 2 0 0 2年 2月 ,由Patrick等首先报道的利用载体在细胞体内稳定地表达siRNA ,从而抑制哺乳动物细胞靶基因表达的方法[1,2]。其基本思路如下 :细胞内存在RNA polymerase III,它可以识别Ｕ6启动子 ,从而使启动子后的基因转录成ＲＮＡ。当模板连续出现 3～ 5个“Ｔ”碱基时 ,转录就会终止。根据这一机制 ,可以设计一种能表达ＲＮＡ的质粒 ,其组成包括四部分 :①常用质粒的基本序列 ;②Ｕ6启动子 ,位于克隆位点的上游 ;③克隆位点 ;④ＲＮＡｉ模板序列 (ＤＮＡ)。这部分序列具有如下特点: 含RNAi序列 ,对哺乳动物而言 ,通常为21-23个核苷酸；发卡结构环状部分 ,通常有 4～ 7个核苷酸 ;靶序列的反向互补序列; 3～5个核苷酸“T”。将具有如上结构的质粒导入细胞内, 体内的RNA polymerase III就可以合成一条ＲＮＡ链 ,这条ＲＮＡ链可以通过两端的 2 1个左右的核苷酸反向互补特性而形成发卡样双链结构 ,从而起到基因抑制作用。这种技术的使用 ,操作简便 ,成本低 ,与直接导入SiRNA相比 ,DNA质粒更易导入细胞内 ,而且质粒导入细胞后存在时间长且稳定 ,对靶基因的表达抑制效率高 ,便于进行较长时间的基因功能研究 ,因而近日来成为一种热门技术 ,Cythla等2002-05对载体进行了改进 ,使RNAi效率提高到 99%以上[3]。他们的作法是 ,在上述载体的克降位点上游加入了人Ｕ6ＲＮＡ的前 2 7个核苷酸 ,在克隆位点下游又加上一段能形成发卡样结构的核苷酸序列及转录终止信号poly(u)。据报道 ,这种改进的质粒大大增加了siRNA的转录效率及稳定性 ,同时对靶基因的抑制作用也大大增加 ,因而被认为是迄今报道的最完善的质粒载体。 ?????胞内表达siRNA，尽管细节各有不同，但载体大都是用RNA聚合酶III（Pol III）启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA) 的序列。选用Pol III启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4—5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有Pol III 启动子和shRNA编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，抑制范围包括外源基因和内源基因。采用这种方法的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起化学合成来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。 ????? pSilencer? siRNA 表达载体系列是用于在培养的哺乳动物细胞中表达siRNA的一系列载体。在载体上包含有RNA Pol III启动子，