重组dna技术资料教材.ppt

* * 第八节 重组DNA技术的应用 (自学) * （一）构建基因组文库 基因组DNA的提取和有限酶解 基因组文库载体的构建 一、构建基因文库（gene library） （二）构建cDNA文库 * （一）方法 寡核苷酸介导的定点诱变 Kunkel法 双链定点诱变 PCR定点诱变 二、基因定点诱变 （二）应用 改造基因 改造载体 * 激素 细胞因子 生长因子 基因工程疫苗 基因工程抗体 三、基因工程药物 血管内皮生长因子（VEGF）可以促进血管侧枝循环，治疗血管栓塞性疾病。某实验室准备在小鼠成纤维细胞3T3中表达一种人源的VEGF。已知VEGF全长600bp，目前可用的克隆载体pGEM-T，真核表达载体见下图。请设计后续实验! 思考题: * * * * * * * T4 Polynucleotide Kinase，简称T4 PNK，中文名称T4多聚核苷酸激酶，是一种多聚核苷酸5羟基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3磷酸基团的单核苷酸的5羟基转移。其他NTP也可产生相同的反应：5-OH + NTP → 5-P + NDP。????上述的磷酸化反应是可逆的。当缺失ATP并且存在ADP的情况下，T4 Polynucleotide Kinase可以显示出5磷酸酯酶的活性，催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3磷酸基团的单核苷酸的5磷酸基团向ADP的转移形成ATP。其他NTP也可产生相同的反应：5-P + NDP → 5-OH + NTP(最适pH为6.4左右)。????当ATP和ADP都适量存在时，T4 Polynucleotide Kinase可以催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3磷酸基团的单核苷酸的5磷酸基团和ATP的γ位磷酸基团之间的交换反应。其他NTP也可产生相同的反应：5-P + NTP + NDP→5-P + NDP + NTP。????T4 Polynucleotide Kinase同时具有3磷酸酯酶活性，可催化3磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化：3-P → 3-OH + Pi(最适pH为5.9左右)。????T4 Polynucleotide Kinase的激酶活性在C-末端附近，而磷酸酯酶活性在N-末端附近。????用途：寡核苷酸、DNA或RNA的5末端标记，用作Southern、Northern、EMSA等的探针，凝胶电泳的marker，DNA测序引物，PCR引物等；使寡核苷酸、DNA或RNA的5端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行；催化3磷酸化的单核苷酸的5磷酸化，使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3末端连接；去除3端磷酸基团。 * pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。质粒载体pBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。质粒载体pBR322的大小为4361bp，相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。 质粒载体pBR322的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。 同时，由于其为人工构建质粒，虽然带有抗药性基因，但已不能在自然界的宿主细胞间转移，同时应用安全菌株，亦不会引起抗生素抗性基因传播。 * pUC18/19是一种常用克隆载体，由pBR322改造而来，含有抗氨苄青霉素基因、Lac Z基因及与M13mp18相同的多克隆位点。这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反。重组pUC18/19的克隆转化细胞可用蓝/白斑法筛选。宿主菌：建议用E.coli DH5α、JM109及XL1-Blue做受体菌。 * * 在基因克隆中的二者的用途不尽相同。插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA * * 酵母人工染色体（Yeast artificial chromosomes 简称YAC），是一种能够克隆长达400Kb的DNA片段的载体，含有酵母细胞中必需的端粒、着丝点和复制起始序