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SRY基因的检测 目的要求 掌握PCR反应的基本原理 掌握性别决定的分子机制 掌握用PCR扩增检测性别的方法 掌握用PCR扩增检测性别方法的应用 原理 1聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）的基本原理是，通过热变性使目的DNA（模板DNA）双链解开；通过退火将引物复性结合到它们的互补位置；通过DNA聚合酶延长引物，反复循环体外扩增出大量一对引物之间的DNA片段。 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction（PCR） 一种可以将目的微量的DNA片断扩增100万倍以上的技术 PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大百万倍 染色体 Mullis (1993) PCR基本工作原理 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板3’和5’端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制延模板链延伸直至完成新的DNA合成。 重复这一过程，可使目的DNA片段得以扩增。 PCR体系基本组成成分 含Mg2+的缓冲液 dNTPs 耐热DNA聚合酶 Tag DNA聚合酶 特异性引物 一对分别与待扩增DNA序列两端互补的寡核苷酸片段。 模板DNA PCR基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 循环 25-30 次 使模板DNA完全变性成单链。同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除 使引物和模板DNA退火结合 此温度下DNA聚合酶以dNTP 为底物催化DNA链的延长 三个步骤为一个循环， 每次循环产物作为下一轮模板进入下一轮循环 第一轮循环 5/ 3/ 3/ 5/ 5/ 5/ 5/ 5/ 引物A 引物B 变性（95℃） 60 75 85 95 90 80 70 65 55 50 45 40 35 30 ℃ 退火（60℃） 延伸（72℃） DNA-Pol DNA-Pol 温度 第二轮循环 5/ 5/ 5/ 3/ 3/ 5/ 5/ 5/ 引物A 引物B 60 75 85 95 90 80 70 65 55 50 45 40 35 30 ℃ 变性（95℃） 退火（60℃） 延伸（72℃） 5/ 5/ 5/ 5/ 温度 DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol 第三次循环 5/ 5/ 5/ 5/ 5/ 5/ 5/ 60 75 85 95 90 80 70 65 55 50 45 40 35 30 ℃ 5/ 变性（95℃） 退火（60℃） 延伸（72℃） 温度 DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol 基因组DNA DNA样品 第一次循环 第二次循环 第三次循环 第四次循环 待扩增序列 引物A 引物B 3/ 5/ 3/ 5/ 5/ 3/ 5/ 3/ PCR的主要用途 PCR的 用途 基因突变 分析 基因的 体外突变 目的基因 的克隆 DNA 序列测定 DNA和RNA 的微量分析 1、与反转录结合，直接从组织细胞中的mRNA 获得目的基因； 2、利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得目的基因片段； 3、利用简并引物从cDNA 文库或基因组文库中获得具有一定序列相似性的基因片段； 4、利用随机引物从cDNA文库中克隆基因。 利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的DNA的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。 PCR技术高度敏感，对DNA的含量要求很低。理论上只要存在一分子的模板就可以获得目的片段。 RNA需要反转录。 利用PCR结合其它技术，可以提高基因突变检测的敏感性。 原理 2 人类个体的表型性别是由Y染色体决定的,具体地说是由Y染色体上编码睾丸发育的睾丸决定因子(testis determining factor,TDF)基因所决定，TDF基因的存在决定着睾丸的发育，即决定个体发育为男性。研究表明TDF基因位于Y染色体短臂与拟常染色体相接的35kb区域，该区域又称为Y染色体性别决定区（sex determining region of the Y，SRY）。 。 3 在SRY基因区域设计特异的引物，如果能够利用PCR技术体外扩增出SRY基因片段，即可判断为男性，否则为女性。本实验在SRY基因区域内设计了一对引物，利用引物Y1.5/ Y1.6扩增出一239bp的片段。 4 利用PCR技术扩增SRY基因片段检测性别具有广泛的实际应用价值，如结合细胞遗传学的核型分析，通过确认SRY所在区域的缺失或易位，诊断46，XY女性或46，XX男性性反转综合征的患者；通过检测胎儿的性别，预防甲型血友病、G6PD缺乏症等X连锁隐性遗传病患儿的出生； 5 通过骨髓移植后Y染色体特异的SRY基因片段的DNA分析是