微生物技术部分.pptVIP

二、基本操作程序（以大肠杆菌的纯化为例） 配制培养基 包装器材 灭菌 菌种扩增 倒平板 接种 倒置培养 观察、记录、分析 保存菌种 高压蒸汽 平板划线法 稀释涂布平板法 恒温培养箱 平板和一个未接种的平板，恒温37℃倒置培养 恒温箱中培养 原液 稀释101倍 稀释103倍 稀释102倍 菌种的保存 （1）临时保藏 固体斜面培养基：4℃，3~6月转接新培养基 （2）长期保藏 甘油管藏： 菌液：灭菌甘油=1：1混合，-20℃ 芽孢 A、某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体，称为芽孢 被埋在琥珀中达2500万年的芽孢，当放到营养培养基上时仍可萌发生长。 ?  * 微量移液器的使用 第一档 第二档 严禁超越两端极限量程 使用结束后，将刻度调回最大量程 一档吸 二档排 * 微量移液器的使用 * 普通培养基在空气中放置10min，培养后出现菌落 哪些方面需要注意呢？培养微生物用什么？实验室提供给微生物的食物是什么？（培养基）住房呢？（培养瓶，培养皿）把微生物放进去的时候会接触到空气，空气中也是有杂菌的，我们是操作者，手，衣服都有微生物。所以方方面面都要注意到。 有什么方法可以去除微生物呢？（分类成消毒和灭菌） 酒精灯在超净台以外（无风）操作的时候，利用火焰气流上升， 在其附近区域可以保证没有空气中的尘埃落下污染培养基等， 5cm左右 * 拿热水烫一下。SARS的时候，我们都带口罩，有些不是一次性的口罩就每天拿热水煮或烫一下。 巴氏消毒法：牛奶（不耐高温的液体） 化学药剂消毒：医院注射之前酒精擦拭 芽孢：细菌的休眠体 孢子：微生物的繁殖体 种方法。本办法，主要用于玻璃制品、磁制品、金属制品、橡胶制品、塑料制品、纤维制品等，用于设施、设备或粉末状的医药品等，使用气体灭菌时，其被灭菌的物品以未变质为前提条件。 　　2、药液灭菌法，是用药液杀灭微生物的方法。本办法主要用于玻璃制品、磁制品、金属制品、橡胶制品、塑料制品、纤维制品等物品的灭菌，还可用于手指、无菌箱或无菌设备等的消毒，药液灭菌用于未变质的物品。通常使用的有乙醇（洒精）0.1—1w/v%盐化苯类溶液、甲酚、苯酚水或福尔马林水等。 * * 在无菌操作时，把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500毫升的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。大概外焰400℃、中焰500℃、内焰300℃，； * 干热灭菌是利用烘箱加热到160-180℃的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用170℃持续90分钟来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免防碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。 1. 培养基的制备 2. 微生物接种（纯化） 3. 恒温箱中培养 4. 菌种的保存 培养基（微生物所需的营养物质，加入琼脂——固体培养基，不加琼脂，液体培养基） 100ml培养基 * 固体培养基——用培养皿，液体培养基——三角瓶，敞着口？棉塞 * 1. 培养基的制备 2. 微生物接种（纯化） 3. 恒温箱中培养 4. 菌种的保存 * 待三角瓶中的LB固体培养基冷到60℃时，关闭紫外灯，点燃酒精灯，用镊子从广口瓶中夹出酒精棉球擦试桌面和手。 注意：一定要在擦试手之前点燃酒精灯，以免发生危险。 在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶中的培养基倒在培养皿里。注意一定不要把培养基沾在培养皿壁上，以免污染。 1.培养基灭菌后，需要冷却到60 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。 为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。 1. 培养基的制备 2. 微生物接种（纯化） 3. 恒温箱中培养 4. 菌种的保存 * 1. 培养基的制备 2. 微生物接种（纯化） 3. 恒温箱中培养