用正交法测定几种素对酶活力的影响实验报告.doc

用正交法测定几种因素对酶活力的影响 一、前言 正交实验法 正交实验法就是利用排列整齐的表- 正交表来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果。正交表能够在因素变化范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，由于正交表具备均衡分散的特点，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。 正交实验设计包括两部分内容:第一，是怎样安排实验;第二，是怎样分析实验结果。 酶活力 酶活力（enzyme activity）也称为 酶活性，是指 酶催化一定 化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一 化学反应的速度来表示，酶催化 反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定 酶促反应的速度。 酶促反应速度可用单位时间内、单位 体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。 二、实验目的 1.学习并掌握正交法应用原理。 2.采用正交法测定多种因素对酶活力的影响。 三、实验原理 酶促反应常常同时受到多种因素(包括激活剂和抑制剂等)的交互影响，可采用正交法进行综合研究，即通过少量试验收到更好的效果：多快好省。本实验以正交法同时测定[S]、[E]、温度和pH值对trypsin活性的影响，以求得酶活最大时相应影响因素的最佳值(水平)，并借此初步掌握正交法的使用。 四、实验器材和试剂 实验器材： ①试管 ②漏斗 ③温度计 ④吸管 ⑤恒温水浴锅 ⑥分光光度计 实验试剂： ①2%血红蛋白液(Hb) ②15%三氯醋酸液(TCA) ③trypsin酶液 ④0.04mol/L巴比妥缓冲 液(pH 7, 8, 9) ⑤考马斯亮蓝染液  五、实验操作 1.实验设计 本实验为四因素三水平(总试验次数34=81)，可选用L9正交表（仅需9次试验)，展开后其特性为均衡搭配 （1）每列中水平数1、2、3出现次数相同，均为3次； （2）每两列的横行数对(1-1/1-2/…/3-2/3-3)各出现一次。 列号 试验号 1 2 3 4 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 2.将各因素及其相应水平参数依次填入得到实验安排表 试验号 试剂/ml 1 6 8 2 4 9 3 5 7 2%血红蛋白液 0.2 0.5 0.8 0.2 0.5 0.8 0.2 0.5 0.8 缓冲溶液 pH7 2.6 pH8 1.7 pH9 1.7 pH8 2.3 pH9 2.3 pH7 2.0 pH9 2.0 pH7 2.0 pH8 2.0 37℃预温5min 50℃预温5min 60℃预温5min 酶液 0.2 0.8 0.5 0.5 0.2 0.8 0.8 0.5 0.2 37℃反应10min 50℃反应10min 60℃反应10min （1）各试管编号，分别加入对应容量的底物(2% Hb)和相应pH值的缓冲液，混匀； （2）同温处理的3支试管同时预温5min； （3）各试管依序分别加入对应容量的trypsin酶液(统一加样时间间隔)，混匀； （4）同温处理的3支试管置对应恒温水浴中反应10min； （5）各试管依次加入15%三氯醋酸液2ml，混匀以终止反应； （6）非酶促对照：另取一试管，先加入2%血红蛋白液0.5ml及pH8缓冲液2.0ml，再加15%三氯醋酸液2.0ml，混匀静置10min后再加入酶液0.5ml； （7）上述各管反应液室温静置15min后过滤，取滤液待测酶活； （8）酶活测定(考马斯亮蓝法，标准曲线制备略)：取试管若干支编号，分别加入对应的样品滤液1.0ml及考马斯亮蓝液4.0ml，混匀，室温静置3min，以非酶促对照管为空白，于波长595nm比色测定。 3.数据记录及分析 将各管测定所得光密度值对应填入表格，分别算出各因素一、二及三水平的试验结果总和Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，并分别取其平均值计算相应的极差(各列中最大与最小值之差)；比较各因素极差的大小以评估各因素对酶活的影响，并对酶活最高时的各因素水平作一直观分析。 六、实验结果及数据处理 1.实验数据： pH值 温度 pH7 pH8 pH9 测量值 平均值 测量值 平均值 测量值 平均值 37℃ 0.003 0.0023 0.068 0.0667 0.185 0.1840 0.002 0.066 0.185 0.002 0.066 0.182 50℃ 0.0