第四章固定化酶与固定化细胞-.pptVIP

第四章　固定化酶与固定化细胞 本章内容 酶的固定化 (1)为什么要固定化? (2)怎样固定化?(固定化方法) (3) 固定化酶的特性 细胞的固定化 (1)细胞固定化所用的方法 (2) 固定化细胞的特性 辅酶的固定化 什么是固定化酶？ 指固定在一定载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。 直接利用微生物酶—— (一)为什么要固定化? 在一定程度上可以改善酶的稳定性； 可以多次反复使用，有利于采用连续操作工艺，从而使酶和细胞的使用率提高，降低生产成本； 酶和细胞不混入产物，可精简产物分离工序。 (1)固定化在一定程度上可以改善酶的稳定性 固定化增加了酶的耐热性（热变性原理） 固定化增加了酶对蛋白变性剂（尿素，盐酸胍）等的抵抗能力 固定化减少了蛋白酶的作用（阻碍了活性部位的接近） (2)固定化使酶和细胞的使用率提高 江南大学的孙志浩通过卡拉胶包埋的方法，使酶的重复利用30个批次后活性没有明显减少，大大促进了酶的利用率，加速了工艺工业化进程． (3)可精简产物分离工序 固定化的第五种方法　变性法 在不使用载体的情况下，借助加热、冰冻或β-射线等物理手段，也可通过添加柠檬酸、各种絮凝剂、交联剂或变性剂处理，使细胞内起破坏作用的蛋白酶变性、细胞结构固定和菌体聚集成大颗粒达到固定化的目的。此法制备的细胞一般只用于完成单酶或少数几种酶催化反应。 (1) 吸附法 物理吸附是通过氢键、疏水键和π电子亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法。常用的载体有高岭土、皂土、硅胶、磷酸钙胶、氧化铝、微孔玻璃等无机吸附剂 离子交换吸附是在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换剂的相互作用而达到固定化的一种方法。最常用的交换剂有CM－纤维素、DEAE－纤维素、DEAE－葡聚糖凝胶等。 吸附法特点 优点：操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心不易破坏，有利于制备高活性酶 缺点：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下酶易从载体上脱落 吸附法（制备的工艺） 水相固定化法 这是最常见的吸附固定化方法，即将酶溶解于缓冲液中，加入载体，振荡或搅拌一定时间后，抽滤、洗涤、冷冻干燥即可得固定化酶 载体表面涂布法 将酶溶入少量缓冲液中，加入载体，混合均匀，冷冻干燥可得固定化酶。此法相当于直接将酶涂布于载体上，避免了水相固定化中酶的大量流失 溶剂沉淀法 即在低温下向含有载体的脂肪酶液中加入酶的有机溶剂作沉淀剂(如丙酮)使酶析出，沉淀在载体表面。此法所得固定化酶酶活性较高，载体性质对固定化无明显影响，但酶在载体表面分布不均匀 吸附法（制备的工艺） 游离固定化法 将具有一定亲水性的载体分散于疏水溶剂中，另将酶粉溶入少量缓冲液的酶液加入，振荡可搅拌一定时间后，便得固定化酶。其原理是：亲水性载体可在其表面形成一层水膜，酶分子不溶于溶剂，只能存在于这层水膜中，因而可以完全被固定化 微晶体法 将可结晶的物质和酶溶液混合在一起，然后滴入亲水有机溶剂中，当可结晶物质结晶析出时，酶就有规则吸附在晶体表面上 电沉积法。在酶溶液中放置两个电极，在电极临近加入载体，通电后，酶移向电极，并沉积到载体表面的固定化方法。采用这种方法时需事先确定载体和酶在电场中是否会分解和失活。在沉积过程中和酶活性、稳定性有关的某些离子如果发生移除、损漏，那么就必须即时补充、替代。 (2) 共价结合法 借助共价键将酶的活性非必须侧链基团或细胞表面基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等）和载体的功能基团进行偶联以达到固定化目的方法。 此法得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用，因此它是目前应用最多的一类固定化酶的方法。 共价结合法example A．重氮法 反应式及原理 B 叠氮法 例 用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下： ⑴ 酯化 ⑵ 肼解 ⑶ 叠氮化 (4) 偶联 B 叠氮法 对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后与酶偶联 。 C．烷基化反应法 含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。 D．硅烷化法 多孔玻璃特点： ① 机械强度好，表面积大。 ② 耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。 D．硅烷化法 一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。 D．硅烷化法 D．硅烷化法 D．硅烷化法 E ．溴化氰法 本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。 E ．溴化氰法 (3) 交联法 利用双功能或多功能试剂在酶分子间、或酶分子与惰性蛋白间进行