EGFR基因突变(ARMS法)检测标准操作规范.docVIP

EGFR基因突变（ARMS法）检测标准操作规范 目的：明确EGFR基因突变（ARMS法）检测操作、结果判断、报告内容及质控管理规程，保证检测结果的可靠性。 执行人：李文辉、郭志云 试剂来源：苏州为真生物医药科技有限公司 质控物：阴性、阳性对照均为试剂配套。 实验操作步骤： 5.1 DNA提取 FFEP样本DNA的提取(QIAGEN) （1）切片、烤片：切3~5张厚度为8~10μm的组织片，捞至普通玻片上（若为小组织，则切10张，同一玻片可捞多张），60℃考片30分钟；大组织另外切一张3μm组织片进行常规HE染色，作病理评估之用。 （2）脱蜡：将组织切片置于二甲苯中室温脱蜡2次，每次10min；随后浸入100%乙醇3min。将组织切片依次室温置于100%、80%、70%梯度乙醇中各2min，复水后，室温浸入去离子水3min。 （3）评估、刮片：组织片经病理评估后，用洁净盖玻片刮取癌组织密集区域，并转移至洁净的1.5ml EP管中；小组织全部刮取至1.5ml EP管中。 （4）消化：加入180μl ATL和20μl蛋白酶K，震荡混匀，根据组织大小可增加消化液的用量，56℃，1h，根据组织大小可延长消化时间甚至过夜消化 （5）升温：将温度调至90℃，作用1h（注意管盖，90℃高温可能会导致爆盖以致液体被蒸发；时间不要太长1小时足够；一个水浴锅时，56℃到90℃之间过渡时应将样本置于室温中，待温度完全升到90 （6）短暂离心使液体聚于管底，加入200μl AL，震荡混匀，然后加入200μl无水乙醇，震荡混匀。 （7）短暂离心使液体聚于管底，将整个液体全部移入收集柱中，然后8000rpm离心1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。 （8）加入500μl AW1漂洗液，离心8000rpm，1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。 （9）加入500μl AW2漂洗液，离心8000rpm，1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。 （10）离心14000rpm，3min，以去除收集柱中的残余液体。 （11）开盖后放置5-10min，以去除残余乙醇。 （12）加入洗脱液20μl，然后室温静置5min。 （13）离心14000rpm，1min，收集洗脱液。 新鲜组织样本（TIANGEN） （1）新鲜组织取量30-50mg（脾组织用量应小于10mg），使用剪刀或者匀浆器将组织剪碎（尽量越碎越好，形成细胞悬液），然后10000rpm离心1分钟，倒尽上清后加入200μl缓冲液GA，震荡悬浮。 （2）加入20μl蛋白酶K溶液，混匀后在56℃放置，直至组织熔解（1-3 （3）短暂离心使液体聚于管底，加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟。（加入GB时可能会产生白色沉淀，70 （4）短暂离心使液体聚于管底，加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀。 （5）短暂离心使液体聚于管底，将管中全部液体及絮状沉淀全部加入到吸附柱中，12000rpm离心30秒，倒掉废液后将吸附柱继续放回收集管中。 （6）加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。 （7）加入700μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。 （8）12000rpm离心2分钟，丢掉收集管，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干残余漂洗液。 （9）将吸附柱置于一个新的干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液TE，室温静置5分钟，12000rpm离心2分钟，收集洗脱液。 5.2实验仪器及试剂的准备 （1）打开仪器开关，仪器进行自检后，确认指示灯显示正常可以使用时，进行后续操作，仪器待用。 （2）冰盒的准备：制备碎冰，以便放置试剂以及冰上进行实验操作。 （3）试剂的处理：将试剂盒中的试剂置于冰上自然解冻，其中聚合酶需要插入冰中，以保护酶的活性。 （4）移液器及耗材的准备：准备好无菌干净的移液器、吸头、PCR管等，确保使用的材料不能对实验结果产生影响。 5.3 DNA浓度测定（PCR法） （1）将已解冻的试剂包括八连管、DNA样本、纯化水，振荡混匀后进行快速离心，然后再置于冰上；DNA聚合酶快速离心后置于冰上。 （2）对需要配制的试剂进行成分计算： 加入组分 体积×n.2（如三份样本则×3.2） PCR MIX 10ul DNA聚合酶 0.2ul 纯化水 7.8ul 总体系 10ul （3）在PCR管冰架上，架上洁净的八联管。 （4）将反应混合物依次加入八联PCR管中，每孔加入18ul，然后小心盖上八联PCR管管盖（不要污染膜或者管盖的表面，以致影响荧光检测）