MTT实验操作流程.docxVIP

···· ···· MTT 实验标准操作流程 原理 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 （ Formazan  ）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（  DMSO ）能溶解细胞中的 甲瓒，用酶标仪在  570nm  波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，  MTT  结晶形成的量 与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（即  OD  值），来判断活细胞数量，  OD  值越大，细胞 活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。 试剂及耗材 CO2 细胞培养箱、生物安全柜、倒置显微镜 、低速离心机、酶标仪、 8道排枪、培养基 胎牛血清 、 MTT 、 DMSO 、 96孔细胞培养板、胰酶、血细胞计数板 注意事项 MTT 溶液的配制，通常 MTT 配成的终浓度为 5mg/ml, 须用 PBS 或生理盐水做溶剂。 MTT 一般最好现用现配， 0.22 μm 过滤后 4℃避光保存两周内，或配制成 5mg/ml 保存在 -20 ℃长期保 存，避免反复冻融，小剂量分装，用避光袋或锡箔纸包住避光以免分解，当 MTT 变为灰绿色时 不能再用。 DMSO 可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除 原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。 实验步骤： 4.1 细胞标准曲线制作 4.1.1 0.5% 的胰酶消化对数期细胞，待细胞即将脱离皿底时，加少量血清终止反应， 1000r/min ，离心 5min ，吸去上清，将细胞沉淀用培养基吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数 后调整其浓度至 5-10 ×10 4/ml。 4.1.2 取4块96孔板，分别标记为 0h、24h 、48h 、72h ，，每组设置 3个复孔，每孔加入 100 μL 细胞悬液，每板分别铺 8组细胞，分别为 3000 、 4000 、5000 、6000 、7000 、 8000 、 9000 、 10000 个/孔，边缘孔用无菌 PBS 填充以消除边缘效应。 4.1.3 5%CO2 ， 37℃培养箱继续培养，每 24 h 取出一块 96孔板检测： 每孔加入 10 μ L MTT溶液（ 5mg/ml ），继续细胞培养箱培养 4-6h ； 小心吸去孔内培养液； 每孔加入 150μ L DMSO，使结晶物充分溶解； 加 DMSO 后 10min 内，用酶标仪检测各孔波长 μl570nm 的吸光值； 4.1.4 标准曲线制作 以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞增殖标准曲线。选择合适的细胞浓度进行实验。 4.2 MTT 药物毒性实验步骤 4.2.1 0.5% 的胰酶消化对数期细胞， 加少量血清终止反应， 1000r/min ，离心 5min ，吸去上清， 将细胞沉淀用培养基吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度至 5-10 ×10 4/ml ，药物 毒性实验一般每孔细胞数量 5000 — 10000 个（具体数目根据预实验判断）。此外，还应根据 细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。 4.2.2 将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入 90μl细胞悬液 , 这样待测细胞的密度为 5000 — 10000/ 孔（边缘孔用无菌 PBS 填充）。 注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降， 因此接种的过程中要反复多次混匀， 如每加 5 个孔就混 匀一次，以确保接种的细胞密℃在各孔之间完全相同，这对于 MTT 的结果至关重要。 4.2.3 5%CO2 ，37 ℃培养箱继续培养，待细胞单层铺满孔底（ 96 孔平底板） ,加入浓度梯度的 药物。（原则上，细胞贴壁后即可加药，或两 h，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板， 次日上午加药。加药时按照所需的浓度在 EP 管中先稀释好，每孔加入 10μl已经稀释好药物， 使每孔最终体积为 100 μl，为了避免产生误差，稀释好的药物体积应略大于所需药物的体积。 需要注意的是，以 DMSO 作为溶剂溶解的药物至少需要进行 100 倍以上稀释才能使用，因为 作用于细胞 DMSO 的含量高于 1% 时， DMSO 会杀死细胞从而影响判断。） 4.2.4 按照药物作用时间点，每 24 h 取出一块 96 孔板检测： 每孔加入 10 μ L MTT溶液（ 5mg/ml ），继续细胞培养箱培养 4-6h ； 小心吸去孔内培养液； 每孔加入 150μ L DMSO，置摇床上低速振荡 10min ，使结晶物充分溶解； 加 DMSO 后 10min 内，用酶标仪检测各孔波长 570nm 的吸光值； 4.2.5 同时设置调零孔（培养基、 MTT 、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物