目的基因的连接、转化、涂板培养_刘玥.pptVIP

（LacZ基因 N端序列） 插入片段 （LacZ基因失活） LacZ基因 Ｃ端序列 LacZ酶 知识回顾Knowledge Review * lacZ：β－半乳糖苷酶基因 氯化钌（liao） * 倒置培养原因：温育的时候，培养基的水分要蒸发，形成水珠，如果正放的话水珠集聚在培养基平面上会影响菌落的生长，所以要保证培养基的干燥，就得倒置培养. 这是一点,还有就是便于拿取,大下小上,不会打掉.也防止外物掉在培养基上. 阳性菌落小量扩大培养，即在5ml培养基中培养，收集菌体，提质粒，进行鉴定：酶切、PCR、测序等。确定是是目的基因插入后，再大量扩大培养，进行表达等操作。 目的基因的连接、转化、涂板培养 生物化学与分子生物学教研室 刘玥 掌握目的基因的重组连接原理及方法。 理解蓝白斑筛选鉴定的原理 熟悉重组DNA分子转化受体细胞的基本思路和方法 目 的 实验总设计 分---PCR分离目的基因 切 接---目的基因与载体相连 转---转入宿主细胞 筛---筛选阳性重组体 接---目的基因与载体相连 原 理： DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个或者几个A碱基的特性 利用T载体3’末端的T碱基和PCR产物的A碱基互补配对,经连接酶作用,完成与载体的连接 是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。 pMDTM18-T Vector ? ? pMDTM18-T Vector 仪器与主要试剂： pMDTM18-T Vector （TaKaRa公司） PCR扩增产物 T4 DNA连接酶 10×T4DNA连接酶缓冲液 ?反应体系 pMDTM18-T Vector连接试剂盒使用说明（TaKaRa公司） ① ② pMDTM18-T Vector 0.5μl 0.5 μl PCR扩增产物 4.5μl Control Insert DNA 1μl ddH2O 3.5μl Solution I 5μl 5μl 总体积 10μl 10μl 16℃反应30-60 分钟 感受态细胞 感受态细胞：经过电击、 CaCl2、 RuCl等化学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。 转---转入宿主细胞 实验原理 ---CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。 实验器材 器材： 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无 菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分 光光度计,微量移液枪。  1.LB琼脂固体和液体培养基。 2.含特定抗生素的LB固体培养基。 3.100mM CaCl2溶液。 4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。 5. 待转化质粒。 试剂 实验步骤 1.挑取一DH5α单菌落于2.5ml LB培养液中37℃过夜培养 2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇培养至OD600值达到0.3-0.4之间 3. 取50ml菌液置于离心管内，4 ℃ 4500g离心5分钟 4. 加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟 5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 6.感受态细胞分装成100μl的小份,暂且不用的贮存于-70℃可保存半年。 取其中一份进行转化。 7. 向转化管中加入DN