实验二_叶绿体的分离与荧光观察.pptVIP

细胞生物学实验 细胞生物学实验 实验二 叶绿体的分离与荧光观察 细胞生物学实验 实验目的 1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 实验原理 细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分离 在等渗溶液中进行组织匀浆、分离 叶绿体的分离采用差速离心或密度梯度离心法进行 利用荧光显微镜观察叶绿体的自发荧光和间接荧光（次生/诱发荧光） 常用的细胞破碎方法 方法 技术 原理 效果 成本 举例 机 械 法 匀浆法 细胞被搅拌器劈碎或受剪切力而破碎 适中 适中 动植物组织或细胞 研磨法 细胞被研磨物磨碎 适中 便宜 植物组织 超声波法 用超声波的空穴作用使细胞破碎 剧烈 昂贵 细胞悬浮液小规模处理 珠磨破碎法 细胞被玻璃珠或铁珠捣碎 剧烈 便宜 细胞悬浮液和植物细胞大规模处理 化 学 法 渗透冲击 渗透压破坏细胞 温和 便宜 血红细胞的破坏 酶消化法 细胞壁或细胞膜被消化，使细胞破碎 温和 昂贵 动植物细胞 增溶法 表面活性剂溶解细胞膜 温和 适中 破碎大肠杆菌 脂溶法 有机溶剂溶解细胞壁 适中 便宜 甲苯破碎酵母细胞 碱处理法 碱的皂化作用使细胞壁溶解 剧烈 便宜 破碎大肠杆菌 离心分离技术 离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力不同介质沉降分离。 分离各种细胞组分的方法主要有： 差速离心 密度梯度离心 速率-区带梯度离心 等密度离心 差速离心 主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。 差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取 密度梯度离心 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分离的方法。这类分离又可分为速率-区带梯度离心和等密度梯度离心两种。 优点是一次离心可分离提纯样品中几种组份，用于较精细的分离。 速率-区带梯度离心和等密度梯度离心 原理：根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，通过离心力场的作用，使不同的颗粒在密度梯度层内形成一系列区带，从而达到彼此分离的方法。 A、速率-区带梯度离心流程图 B、等密度梯度离心流程图 原理：根据不同颗粒在密度梯度介质中存在着浮力密度差，在离心力场作用下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的颗粒得到分离的方法。 两种密度梯度离心方法的异同 特 点 速率-区带梯度离心 等密度离心 分离方法的主要依据 主要依赖分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同 依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的 介质密度梯度选择 最大密度必须小于样品中粒子的最小密度；梯度平缓 覆盖了待分离物质的密度；梯度陡度较高 离心介质的主要作用 减缓颗粒扩散速度 阻止颗粒移动；筛选与分离颗粒 分辨率范围 沉降系数相差～20%的物质 颗粒密度差异大于1% 离心后区带形成位置 易变(样品易扩散） 不变（样品不扩散） 影响样品区带形成的主要因素 离心时间（过长或过短都不利） 颗粒样品密度 一般操作方法 介质梯度应预先形成 ，离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心后形成区带。 介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心自形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。 常用介质 蔗糖、甘油 蔗糖 、甘油、 CsCl、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。 表1:各种亚细胞构造在不同的离心介质中分离所需的离心力与时间 结 构 差速离心 (在0.25M蔗糖溶液中) 速率-区带梯度离心 (5 ～50%蔗糖) 等密度离心 (其他介质,如CsCl等) 细胞核 800-1000g ×10min 500g ×10min 4000g ×60min 线粒体 10,000g×20min 5000g ×10min 80000g×100min 溶酶体 10,000g×20min 5000g ×10min 80000g×100min 质膜(大片) 100,000g×15min ～100,000g×100min ～ 150,000g×600min 内质网片段 150,000g×40m