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Part I T细胞表型测定（一） Part II 小鼠脾细胞分离技术 实 验 一 潍坊医学院免疫学教研室 林志娟 Tel：8462530 Email：myx@wfmc.edu.cn Part I T细胞表型测定（一） ---免疫细胞的分离、细胞涂片、固定及保存 【原理】 T细胞是一个复杂的，不均一的整体，根据其发育的不同阶段，表面标记以及功能，可将其分为不同的亚群。T细胞介导细胞免疫应答，并且对B细胞介导的体液免疫应答起到辅助和调节作用。 T细胞表面标志的检测，有助于了解机体的细胞免疫功能，对免疫缺陷病、肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、移植排斥反应等疾病的诊断、分型、预后和疗效观察有着重要的意义。 共有标志：CD3+--总T细胞 特有标志：CD4+T细胞--辅助细胞， CD8+T细胞--杀伤细胞。 T淋巴细胞表面标志 外周血正常值 CD3:60~80%；CD4:35~55%；CD8:20%~30% CD4/CD8:约1.4~2.0 CD4/CD8＜1.4： ① 免疫缺陷病，如艾滋病≤0.5；② 恶性肿瘤； ③ 再生障碍性贫血；④ 某些病毒感染。 CD4/CD8＞2.0： ① 自身免疫性疾病，如SLE、类风湿关节炎等。 SABC-AP法测定T细胞亚群 SABC：链酶亲和素－生物素 链酶亲和素：一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子结合。亲和素与生物素一经结合就极为稳定，形成一种类似晶格的复合体。 AP：碱性磷酸酶。 酶标生物素 + 亲合素 A+B T cell 待测T细胞 CD分子（？？？） 一抗 二抗 （碱性磷酸酶的）底物 实 验 基 本 流 程 间接SABC-AP法  ---- T细胞亚群检测 淋巴细胞＋小鼠抗人CD3/CD4/CD8分子单克隆抗体（一抗） 二抗（生物素化） 标有AP的SABC 酶底物显色剂（BCIP/NBT） 酶将底物催化显色，阳性细胞膜上显色。 此为间接法。 直接法：不用二抗，将SABC物直接标记于一抗。（一抗价格昂贵） SABC系统对抗原抗体反应起到放大作用，提高反应的敏感性。 【实验材料】 肝素、淋巴细胞分层液、Hank’s液、PBS等； 一次性注射器、试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显微镜，温箱等。 鼠抗人CD3、CD4、CD8 单克隆抗体（一抗）；羊抗鼠IgG（生物素化二抗）；SABC-AP；底物（BCIP/NBT 磷酸甲苯胺蓝盐）等。 【实验步骤】 标本的制备：淋巴细胞悬液的制备 标本的染色： 结果的观察： 1、标本制备：淋巴细胞悬液的制备 （1）取肝素抗凝血5ml与5mlHank’s液稀释混匀，每组取2ml，用滴管贴管壁轻轻叠加于2ml淋巴细胞分层液上，配平后1500rpm离心10mins。 （2）洗涤细胞：用滴管仔细吸出位于血浆和分离液之间乳白色的淋巴细胞，（滴管吸之前先排除空气，防止分层；滴管转动一圈确保都吸完）放入盛有2mlPBS液的试管（吹打目的洗细胞表面杂质，暴露表面分子），1500rpm离心10mins，弃上清（直接倒一次），将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入PBS液洗涤， 1500rpm离心5mins；加入2ml重复洗涤一次。 （3）弃上清，淋巴细胞沉淀用200μl以上PBS溶解，取20μl细胞涂片，下一次实验检测T细胞亚群用。 2、标本染色 细胞涂片用记号笔划圈，滴固定液1滴，室温固定2~3min（已做） 滴加鼠抗人CD3、CD4、CD8抗体15μL，轻轻摇晃，使单抗均匀铺在细胞表面，37℃孵育2~3h（使Ag-Ab结合），PBS洗3次（洗掉没结合的一抗）。 滴加生物素标记羊抗小鼠抗体15μL ，37℃孵育30~45min，PBS洗3次。 滴加SABC 15μL ，37℃孵育30~45min，PBS洗3次（洗掉没结和的二抗）。 滴加显色剂30~50μL ，室温显色20~40min。可在显微镜下观察，待细胞膜上出现红色标记物时，用PBS淋洗。 滴加细胞核复染液1滴，30秒后自来水淋洗。 显微镜下观察结果。 【注意事项】 以上操作中，37℃孵育时应将玻片置于湿盒中，切勿干片，特别是加底物后，干片将导致阴阳性结果不能分辨。 观察结果时应使涂片保持湿润。 【结果观察】 高倍镜下计数100～200个单个核细胞。计算阳性率。阳性细胞：细胞表面呈红色。① 标准阳性：细胞表面呈红色，可见深蓝色细胞核；② 强阳性：细胞周缘及中央均呈红色，看不见