蛋白纯化经验.docVIP

1)?硫酸铵沉淀后直接过疏水柱，应该用多大浓度的硫酸铵平衡柱子啊 看你蛋白情况了,一般也就2M左右吧.挂不住就提高浓度,挂太牢就适当降低盐浓度,一般要根据实验决定.我一般就用苯基琼脂糖凝胶,一般纯化IgG用0.7M硫酸铵就可以挂住. ? 你有个贴子中说在纯化过程中上样的样品中pH和盐浓度,以及种类等组分一定要平衡缓冲液完全相同至少相当。我想试试你说的硫酸铵沉淀后直接过疏水柱，那我是不是要先确定复溶后样品的盐浓度再确定平衡缓冲液的盐浓度啊，如果是我怎么检测样品的盐浓度啊 ? 其实差不多就可以,也不一定特别严格,例如疏水盐浓度你的样品的盐高于平衡的也可以,但是别相差太多,尤其不能样品的盐浓度小于平衡缓冲液,这样也许挂不住,或者会产生沉淀.而缓冲液和盐浓度不同混合也许会产生沉淀,所以要小心,而一样的缓冲液体系和盐浓度可以避免这样的问题. 硫酸铵沉淀后的样品,如果是上清按盐浓度稀释到你缓冲液盐浓度就可以,如果是沉淀,直接用缓冲液去溶解,沉淀里的盐可以忽略. 最好的办法你可以用电导的方法去检测,只要样品的电导和你的平衡缓冲液一样就可以了. ? 2)我在用镍柱亲和纯化后，蛋白已经比较纯了，仅在银染时能看见微弱的杂带（目的蛋白约25KD，杂蛋白约40KD)。但我还想试试能不能完全去除杂带。此前试过分子筛没效果，所以想试试离子交换。想请教一下，在变性条件下可以做离子交换吗？和复性后再做比起来哪个