胶体金快速免疫诊疗技术讲义.pptVIP

胶体金快速免疫诊疗技术; 层析法技术优势:简单\现场\快速; 与常规诊断方法相比 ; 技术应用;试纸条组成结构;;免疫层析法检测原理分类介绍;免疫层析法检测原理分类介绍（双抗体夹心）;免疫层析法检测原理分类介绍（竞争反应）;抗体 Antibody; 胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。; 容器硅化处理：玻璃表面少量的污染会干扰胶体金 颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗、硅化。将玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用 。 ;胶体金的制备 ;; 胶体金的鉴定; 免疫胶体金的制备 胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。蛋白质的预处理:1.蛋白质应先对低离子强度的水透析，去除盐类成份。盐类成份能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在。 2.用微孔滤膜或超速离心除去蛋白质溶液中的细小微粒。 3.胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或略偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。 ;蛋白质最适用量测定: 将待标记的蛋白质（鼠抗人IgG）储存液作系列稀释后，分别取0.1ml加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2小时。 ;1;不稳定的金溶胶将发生聚沉，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定???的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。  胶体金与蛋白质偶联后，加入稳定剂，以避免产生凝集。一般选用PEG（分子量为20000）和牛血清白蛋白作稳定剂。加入的量：5％BSA使溶液终浓度为1%；1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。 ;①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH。②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液搅拌2～3分钟。③加入5ml1%PEG20000溶液。④于10000～100000g离心30～60分钟小心吸去上清液（切忌倾倒）。⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以 A540nm=1.5左右为宜，防腐置4℃保存。⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含 0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2。　　以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。;胶体金蛋白结合物的质量鉴定 平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。 OD520nm值测定：用PBS液（含1%BSA）将胶体金蛋白试剂作1:20稀释，OD520＝0.25左右。一般应用液的OD520应为0.2～0.4。 金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法。将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。 ; 胶体金蛋白结合物玻璃纤维素膜制备;选择NC膜;抗原、抗体包被固相NC膜的制备;溶液喷点(喷点演示:BIODOT XYZ系列喷点仪器);干 燥;试纸条组装;切条\包装;;质量控制;;