基因工程制药讲义.ppt

基因工程制药;作业 查阅资料，准备ppt、课程论文介绍某种基因工程药物的生产工艺。;一、基因工程药物;基因工程技术可生产的药物和制剂包括： （1）免疫性蛋白：如各种抗原和单克隆抗体； （2）细胞因子：如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子； （3）激素：如胰岛素、生长激素、心素纳； （4）酶类：如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。; 主要基因工程产品的研制、开发、上市时间;美国已批准了56种生物制剂部分摘录（1）;美国已批准了56种生物制剂部分摘录（2）;美国已批准了56种生物制剂部分摘录（3）;基因工程技术生产药物的优点： （1）利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽，为临床使用提供有效保障； （2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的引用范围； （3）利用基因工程技术可以发现，挖掘更多的内源性生理活性物质； （4）内源生理活性物质在作为药物使用存放的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去; （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 ;我国基因工程药物研究和开发：起步较晚，基础较差。α1b 型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于1997年 通过Ⅲ 期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研究开发中的也有10余种。;2006年4月前我国批准上市的35种生物技术药物;胰岛素 ;基因工程（genetic engineering）：也称基因操作、遗传工程，重组体DNA技术，基因克隆或分子克隆，指将不同生物的遗传物质——基因，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体（质粒、噬菌体或病毒等）转入微生物、植物或动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。;供体细胞; ;基因工程的操作流程;基因工程制药的基本过程;;目的基因的获得;酶切法直接分离目的基因;plasmid DNA;gagctc;限制性内切酶在DNA克隆中的应用;PCR;PCR的基本原理;模板DNA;;;;;;; ;PCR;片段化、分级分离;;化学合成目的基因;什么是载体？;;三个显著特点： （1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。 （2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因Lac Z′，可利用?-互补原理进行蓝白斑筛选。 （3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。 ;连接;转化受体细胞;1、抗药性检测筛选法;2、显色检测;3、限制酶切图谱检测;4、PCR扩增检测;5、原位杂交检测;;;双脱氧末端终止测序法的基本反应：GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA;双脱氧末端终止测序法 ;;;测序读片;;测序结果;7、外源蛋白质检测;受体细胞选择; ;;2、枯草杆菌表达系统 枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。 优点： 枯草杆菌具有胞外酶分泌－调节基因，能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。 枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。 枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。 枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。 应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。;在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹或无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。 如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在。 在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作。 ; 融合型表达;;常用的受体蛋白（原核细菌表达的蛋白质）;（D3）受体蛋白的切除方法;;分泌表达蛋白 ;分泌蛋白表达的原理图示