流式细胞仪的原理及应用.ppt

流式细胞术的基本概念 CD:是cluster of differentiation 的缩写，指的是分化群或分化簇，即将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原归为一个分化群，每一CD分子代表一种或一类分化抗原。 Antibody：抗体是能与抗原特异性结合并具有免疫活性的球蛋白。它一般是由抗原刺激B细胞分化成浆细胞后产生的。抗体分子具有结合部位(结合簇)，能与对应的抗原决定簇结合。抗体与不同的抗原结合往往出现不同的反应，因而常给抗体以不同的名称，如凝集素、沉淀素、抗毒素、溶血素、溶菌素等。 流式细胞术的基本概念 Fluorescein ：荧光素，是指在一定波长的电磁波（常为蓝光或紫外光）照射下能发出荧光的一类染料 ；常见的荧光素有异硫氰酸荧光素 ( fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻红蛋白（R-Phycoerythrin,R-PE）、别藻青蛋白（allophycocyanin,APC）、多甲藻叶绿素蛋白（ peridinin chlorophyll protein, PerCP）等。 光信号检测常见荧光染料的发射波长 荧光补偿原理 颜色补偿：采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时，都需要作颜色补偿。 带通滤片接受的是一定带宽波长的荧光，故会有干扰光同时被接收，然后一同进入PMT进行光电转换并放大。 通常干扰光占该染料所发出荧光总量的X% 补偿模型图 当前生产流式细胞仪的公司 BD公司 贝克曼-库尔特公司 Cytomation公司 Bio-Rad 公司 Partec公司（德国） Applied Biosystems公司 BD公司简介 BD公司是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于1897年在纽约创立的,总部位于美国新泽西州 BD公司流式细胞仪产品 BD公司流式细胞仪产品 FACS Vantage SE-大型分选机 贝克曼-库尔特公司流式细胞仪产品 FC 500 全自动分析仪 AppliedBiosystems公司 AttuneTM 声波聚焦细胞分析仪 细胞内和细胞外发生了什么事件？ 流式细胞术在临床血液学中的应用 简介 CBA：流式微球阵列又称液相多重蛋白定量技术，是指用一系列荧光强度不同的微球，将可溶性微粒进行捕获并检测的流式技术。每个CBA微球在FL3有特定的荧光强度，大小一致，包被有适用于特定分析（如其他抗体或可溶性蛋白）的特异性抗体，提供了类似ELISAs孔板的捕获表面。简而言之，将包被有不同抗体的微球混合在一个样本中即可进行多参数检测。这种技术可大大节约样本用量，避免ELISAs分析时对样本过度稀释导致分析灵敏度的降低。 CBA原理 操作步骤 检测物与捕获微球共孵育; 洗涤; 标记荧光探测试剂（FITC或PE标记）; 洗涤; 流式细胞仪检测; CBA分析软件批量数据分析。 CBA分析软件 CBA技术   能够同时对单个样本进行多种检测。 较传统检测大大节省样本量。 与ELISAs相比灵敏度高、重复性好。 所有分析只需一组标准曲线。 避免酶联反应所致人工假象。 节省操作时间。 节省检测时间。 细胞凋亡 细胞膜分析-PS外翻（建议用于悬浮细胞） PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白Annexin-V可与PS结合 Annexin V Assay/PI能够区分死亡与凋亡 Thank you for your attention! 正常人血液白细胞免疫表型散点图 正常人血液细胞免疫表型 T淋巴细胞：CD45++++、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD5+/CD7+，部分细胞CD（16+56）+，无CD4+CD8+双阳性细胞 B淋巴细胞：CD45++++、CD10-/CD19+、CD20+/CD22+、HLA-DR+/CD13- NK细胞：CD45++++ 、CD（16+56）+/CD3- 单核细胞：CD45+++、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+ 中性粒细胞：CD45++、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表达更高 嗜酸性粒细胞：CD45+++、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表达更高 正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图 正常人骨髓细胞免疫表型 淋巴细胞:CD45++++、CD34-/CD38+、CD5+/CD7+（T淋巴细胞）；CD10-/CD19＋（B淋巴细胞） 单核细胞:CD45+++,CD34-/CD38+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+、CD36+/GlyA- 粒系细胞: 原粒细胞CD45+、CD3