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分子生物学实验（十） 湖北民族学院 基础医学实验教学示范中心 聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction, PCR） 湖北民族学院 医学基础课实验教学示范中心 模板DNA： 恩施州土家族人群人血DNA 目的基因： GSTM1基因 一、实验目的 1、熟悉PCR技术的基本原理 2、掌握其操作方法 3、了解引物设计的一般要求 二、实验原理 PCR是一种体外扩增特异性DNA片段的技术，可在体外特异的对目的基因进行大量扩增，其巧妙之处在于预先设计合成二段分别与待测目的基因两端互补的引物，以起到指向定点的作用，再借助于DNA聚合酶催化的若干次扩增反应，即可使特定的基因片段成百万次的扩增。 1、变性 通过加热使双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。 2、退火 当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多与模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链。 三、 基本反应步骤： 3、延伸 在DNA聚合酶和4种dNTP及Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶催化以引物为起始点DNA链的延伸反应。 以上3步为一个循环，其产物可作为下一循环的模板，经若干次循环，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到大量复制。 四、试剂 （一）制备模板DNA的试剂 1、裂解液 2、8M KAc 3、氯仿 4、无水乙醇 5、70%乙醇 6、TE缓冲液 7、RNA酶 10mg/ml 8、3M NaAc（pH4.8） 9、蛋白酶K 20mg/ml （二）PCR反应体系 1、引物 2、dNTPs 3、10×PCR buffer 4、Tap聚合酶 5、模板DNA 五、主要实验仪器 1、台式高速离心机 2、PCR扩增仪 3、电泳仪、电泳槽 4、可调式微量加样器及吸头 5 、凝胶成像系统 六、实验步骤 （一）PCR反应 1、按下列次序将各组分加入0.2ml灭菌管内并混合。 10×PCR buffer 8μl dNTPs 200mmol/L 引物1 0.2mmol/L 引物2 100pmol Taq酶 1.5u 模板DNA 100ng 加水至总体积 25μl 2、94℃预变性3min。 3、94 ℃ 1min → 59 ℃ 1min → 72 ℃ 1.5min 共35个循环。 4、72 ℃ 延伸10min。 5、冷却至4 ℃用于电泳或转至-20 ℃ 保存。 （二）PCR产物的凝胶电泳分析 PCR产物可通过凝胶电泳检测其扩增片段大小，以及有无预期特定片段长度DNA扩增产物的生成，分析PCR的效果及特异性，或判定有无特异的扩增反应进行，以达到基因分析的目的。 七、思考题 1、PCR与分子杂交的区别。 2、为什么强调引物设计的原则性。 * *