疫电子显微镜技术-电镜技术.ppt

IFNg-R IgG Κ ，λ * * * * * * * * * * * * * * * * * * IgG之分布，免疫复合物及GBM处沉积（抗基膜性肾炎） * 免疫电子显微镜技术 0.2mm 0.2μm 0.2nm 像差、衍射效应 像差 电镜基本技术 取材 关键 快、准、轻、小 1mm3 组织块 取材，固定，脱水，浸透，包埋，切片，染色 固定 戊二醛 — 锇酸双重固定 保存组织的精细结构 脱水 丙酮、乙醇梯度脱水 包埋 包埋剂—多用环氧树脂类 高温聚合（60oC 恒温箱） 切片 超薄切片50nm ± 粘附于铜网上 染色 “电子染色” 结构图像之间的反差 醋酸铀—柠檬酸铅双染色法 重金属盐类染色剂 电镜观察 免疫电镜（Immunoelectron microscopy,IEM） 免疫细胞化学反应 高电子密度 亚细胞水平定位抗原（抗体） 探讨：病因、发病机制，组织发生 注意结合光镜 免疫电子显微镜技术 X45,000→ ←X7,500 标记物 酶、铁蛋白、胶体金 1 .酶标记－HRP(40KD) 小，易穿透，稳定 通过戊二醛（过碘酸钠），将抗体IgG或SPA与HRP交联 直接法、间接法、PAP法、ABC法等均可 Fab’－HRP 分子量小（70KD）利于抗体穿透 优点：可借鉴免疫组化（光镜）所用之试剂、操作 步骤、及所示结果，易获成功 缺点：弥散，密度较低，定位精确性较差，不宜对比染色 PDGF-R 2.铁蛋白 12nm颗粒（大），中心是Fe(OH)3 外围蛋白质 分子量大（440KD），穿透力差 易与环氧树脂非特异吸附而出现背景“着色” 3.胶体金 理想 2HAuCl4+ 3H2O2 2Au–+8HCl+3O2 (还原剂) 胶体金颗粒 （溶胶) —— Au IgG (IG) Au SPA (PAG) 密度梯度离心 柱层析（S－400） 去除大颗粒聚合物及未标记蛋白 还原剂 白磷 5nm 抗坏血酸 8～13nm 枸橼酸钠 15nm 双标或多标 TNF-R1 ×21000 VWF ×73000 TNF-R2 ×46000 胶金标记之优点： ① 抗体活性高 ② 可作光镜对照观察（免疫金银法） ③ 可作对比染色，超微结构清晰 ④ 可作双标或多标记 ⑤ 颗粒可定量计数 注意： ⒈ 间接法时，一抗不能用Fab’；用PAG时，一抗不能用羊IgG ⒉ 小颗粒（5nm）胶体金不易观察 包埋前法（浸透法） 免疫细胞化学反应→超薄切片制备 → 电镜观察 （厚片） 包埋后法（浅表法） 超薄切片制备 → 免疫细胞化学反应→电镜观察 （固定、脱水、包埋、超薄切片） 不包埋法 冰冻超薄切片→免疫细胞化学反应→电镜观察 包埋前法 1. 取材：新鲜、1mm3（脑、脊髓灌注固定后取） 2. 固定与切片： ①前固定：处理好“保持抗原性与保持超微结构”的矛盾 ②复合固定液的应用 PG固定液：1 ～ 4% Paraformaldehyde 0.01～0.2％ Glutaraldehyde PLP固定液：Periodate-lysine-Paraformaldehyde （配制方法见附录） ③厚切片（10～40μm） 振动切片机的应用，或浸泡于20～30%蔗糖溶液、 速冻、冰冻切片 ④继续固定 4℃ 4～5h ⑤彻底清洗 4℃ PBS(含2～5％蔗糖)过夜 3．免疫细胞化学标记 注意： ①用漂染 ② 增加抗体浓度（4～5倍） ③ 1%BSA的应用 ④ 用免疫酶标时，免用H2O2 ⑤ 想方设法增加抗体之穿透力 ① 去垢剂的应用 0