原生质体培养和融合.pptVIP

第八章 原生质体培养和融合 第一节 原生质体分离与纯化 原生质体是指除去全部的细胞壁后，细胞膜所包围的裸露细胞。 植物体细胞杂交是指通过原生质体融合和异核体的培养产生体细胞杂种的技术，它能使两亲本不通过有性过程进行遗传物质的重组，包括核基因和胞质基因的重组。 原生质体---指被去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活活力力的裸露植物细胞。 一、原生质体的分离1. 供体材料 一般来说，可供分离原生质体的材料是非常广泛的，不同的植物有不同的选择，植物体的组织与器官如根、茎、叶、花、果实、种子等均可作为原生质体的供体材料。 用于植物原生质体主要来源于各种植物的叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞。 ***以叶片用以分离原生质体材料:1、是未经愈伤组织阶段，材料的遗传背景相对一致。2、是易于制备，且时间短。3、是若将叶片原生质体用作体细胞杂交的亲本，由于叶片中明显的叶绿体，可方便地鉴别出异核融合体。 ***禾本科和豆科等，很难从叶肉细胞中分离到原生质体，以无菌悬浮细胞和愈伤组织为供体材料：1、取材方便，培养细胞处于无菌状态，免去了在材料消毒过程中所造成的损伤及污染。2、细胞处于旺盛的分生组织状态，有利于原生质体再生。3、培养细胞对酶的耐受性较好。 2. 原生质体解离 原生质体分离方法有两种， 即机械分离法和酶分离法。我国植物原生质体培养中一般采用酶分离法，材料和酶液的重量比一般为1: 10。对于酶分离法，酶和稳压剂是分离原生质体的关键成分。植物的细胞壁的基本成分是纤维素、半纤维素和果胶质，为使细胞壁降解必须使用能水解纤维素、半纤维素和果胶质的酶制剂。 使用的酶主要有： 纤维素酶(Cellulase)、 果胶酶(Pectolyase)、 离析酶(Macerozyme )、 半纤维素酶(Hemicellulase) 崩溃酶(Driselase)， 其中纤维素酶和果胶酶是最必要的。 酶液中的渗透压是原生体分离的另一个因素，植物细胞去壁后，必须由合适的渗透压替代细胞壁维持的机械压力，酶液中的渗透压过低会使细胞吸涨而破裂；渗透压过高，细胞除受到渗透压力而破裂外，还会损害细胞生长代谢 。 渗透压稳压剂基本上都是甘露醇，但也有采用山梨醇的。 酶液中还应适量地加入其它一些辅助成分：如pH值稳定剂、葡聚糖硫酸钾、CaCl2、KH2PO4等。葡聚糖硫酸钾。 CaCl2和KH2PO4有利于原生质体的稳定， CaCl2还兼具保护质膜的作用。除稳定酶解液pH值外，PVP还能吸附酚类物质， 抑制原生质体的老化褐变。分离出的原生质体用于培养之前， 还需纯化。 二、原生质体纯化方法 供体组织经酶解处理后得到原生质体、破碎细胞、未完全去壁细胞、多细胞团以及组织残体等组成的混合物，因此需要纯化。纯化的方法主要有漂浮法、沉降法及界面法。 **漂浮法：根据原生质体与细胞碎片的比重不同，采用比原生质体相对密度大的溶液如高浓度糖或糖醇，经离心使原生质体悬浮于溶液表面，碎片、叶绿体、维管组织及具壁细胞沉降到管底，原生质体因而得以纯化。 ***沉降法：利用密度不同沉降速率不同的原理，低速离心使原生质体沉于离心管底。此法方便，但不易除尽一些完整的细胞或破碎的原生质体。***界面法利用原生质体和破碎细胞比重不同，低速离心条件下完整的原生质体漂浮于密度不同的两相分界处，碎片留在低层相中，可从两相界面收集到高纯度原生质体。 第二节 原生质体的培养一、原生质体培养的方法1. 液体培养 培养基中不加凝固剂，仅仅用液体培养基按所需植板密度重悬原生质体后，直接植板在培养皿中即可。 液体浅层培养法是目前原生质体培养中广泛应用的方法之一。优点：操作简便，对原生质体伤害小，有利于通气。缺点：容易使原生质体互相粘连、聚集，导致原生质体损坏；并且难于定点观察监测单个原生质体的发育过程。 液体微滴培养 将悬浮密度为104~105/ml的原生质体培养液用滴管以0.1ml左右的小滴一滴一滴接种在培养皿上,如果将培养皿翻转,则为悬滴培养。 优点:如果其中的一滴或几滴的污染,不会殃及整个实验室。 缺点:原生质体分布不均匀;液体易挥发(导致浓度变化)。 2. 固体培养法（1） 看护培养法（饲养层培养） 将原生质体与一些被X射线照射而失去分裂能力的原生质体相混合并包埋在琼脂培养基中，或者把经X 射线处理过的原生质体用一薄层琼脂培养基固定在下层，而活的原生质体在上层。这一方法能允许原生质体密度低于能正常生长的密度，因为它们可以从被处理过的原生质体那里获得一些有益的物质。 （2） 琼脂糖包埋培养法 琼脂糖包埋培养时，