人工色素与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱研究.pdfVIP

张俊婷 人工色素与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱研究 一、 实验目的 熟悉荧光分光度计的结构、原理及操作，学会利用荧光光谱法研究人工色素 引起牛血清白蛋白淬灭的机理。 二、 实验原理 当物质分子吸收紫外及可见区电磁辐射后，它的电子能级由基态跃迁至激发 态，又很快地以电磁辐射形式将这部分能量释放出来，回到基态，我们称它 为光致发光。最常见的两种发光现象。 血清白蛋白是人和动物血清中含量最丰富的一种蛋白质,与各种带正负电荷 的物质及电中性物质均有一定程度的相互作用。各种药物进入体内首先与血 清白蛋白结合,通过血浆的存储和运输,到达受体部位产生药理作用。测定血 清白蛋白的变化,可为疾病诊断、疗效观察提供有价值的资料及数据。因此, 从不同角度研究以白蛋白为代表的蛋白质与具有生物活性小分子间的相互 作用,对了解药物的作用机制具有重要意义。通过对荧光光谱的研究,可以获 得蛋白质分子中荧光生色基团的种类、结构和所处微环境及其分布情况等有 用信息,同时还可以得到外源物质与生物大分子相互作用的有关数据。目前已 有多篇文献采用荧光光谱法研究药物分子如槲皮素、甲基硫菌灵等与血清白 蛋白的相互作用。 人工色素对 BSA 有较强的荧光淬灭作用，引起BSA 荧光猝灭的原因可 能有动态猝灭和静态猝灭两种。 动态猝灭过程遵循 Stern2Volmer 方程 F0 / F = 1 + KSV [Q ] = 1 + Kqτ0 [Q ] (1) 式中, F0 和 F 分别表示不存在和存在猝灭剂物质的荧光强度; [Q ]为猝 灭剂的浓度, KSV 为动态猝灭常数,Kq 是由扩散过程控制的双分子动态猝灭 速率常数 。τ0 为没有猝灭剂存在下荧光分子平均寿命,生物大分子荧光寿命 约为 10 - 8 s。 静态猝灭过程遵循下式: F0 / F = 1 + KS [Q ] (2) 式中, KS 是静态猝灭常数。随温度的升高动态猝灭常数会增大,而静态猝灭 常数随之减小,可由此判断荧光猝灭类型。 当小分子与大分子结合时其表观结合常数 Kb 与结合位点数 n 由下式 求出: lg[ ( F0 - F) / F] = lgKb + nlg[Q ] 由此可求得结合位点数，再结合其他数据可判断结合位点的位置。 本文采用荧光光谱法研究了人工色素与牛血清白蛋白(BSA) 间的相互 作用,探讨了核黄素与BSA 作用机制,计算得到荧光猝灭常数, 以及与BSA 作 用的结合常数和结合位点数等信息。 三、 仪器与试剂 日立F-4500 荧光分光光度计（附石英比色皿）；IKA 磁力搅拌器（附水浴缸）； 0.05mol/L Tris-HCl 缓冲溶液 （含 0.05mol/L NaCl ），PH 7.4 ； 牛血清白蛋白 （BSA ）标准溶液：2×10-5mol/L ，用上述 Tris-HCl 缓冲溶液配 制； 色素溶液：0.2mg.ml-1，用无水乙醇配制于 50mL 容量瓶中。 四、 实验方法 1. 取 只 10mL 比色管，按下表中数据配制系列溶液，用上述 Tris-HCl 缓 冲溶液定容。在 25 ℃水浴中恒温 0.5h 后，采用 1cm 石英比色皿，设置激 发波长为280nm,绘制300-450nm 的荧光光谱。固定△λ=60nm 和△λ=15nm 扫描其同步荧光光谱。 样品编号 1 2 3 4 5 6 7 2×10-5M BSA/mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5