PCR的经验与教训.ppt

设置程序： PCR 反应条件如下： 步骤 循环数 步骤 温度 时间 逆转录 1 1 42℃ 30 min 失活 MLV， 激活 Taq 实时荧光 定量 PCR 2 X℃ 30 sec 40 3 72℃ 30 sec 1 1 95℃ 10 min 1 95℃ 15 sec TaqMan法与SYBR Green 1法的比较 定量与普通PCR的差别 PCR的小技巧 模板：纯度要高，完整性要好，浓度要适当 引物：一次多设计几组，同时PCR；拿到的引物一般是干粉，尽量用其中一管，避免反复冻融；前期引物设计多花心思，提高引物质量 聚合酶：有条件者全程用Pfu高保真酶，防止突变；严格放置冰盒，防止失活 操作细节：全程严格无菌；所有东西现配现用；动作轻柔；有针对性地做温度梯度、引物梯度、模板浓度梯度 实验室现有的PCR仪 细节决定成败公用平台的维护，人人有责 谢谢大家！ PCR的经验总结 ——中心实验室 内容提要： PCR的简介 PCR的原理 PCR的操作步骤 PCR的结果分析 相关PCR技术简介 PCR的简介： 年 Kary Mullis发明 1985年 开始有文章发表 1993年 获诺贝尔奖 广泛用于分子生物学领域 PCR的简介： 聚合酶链式反应，简称PCR（Polymerase Chain Reaction），指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。 PCR的原理： PCR的操作步骤 标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液10μl 4种dNTP混合物各200μmol/L 引物10～100pmol 模板DNA 0.1～2μg Taq DNA聚合酶2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至100μl PCR的反应流程： 温度与时间的设置： 变性温度与时间：一般93℃～95℃，1min足以使模板变性，若低于93℃则需延长时间，但温度过高对酶的活性有影响。引物10～100pmol 退火(复性)温度与时间：取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度，对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想。 按下公式计算：Tm（解链温度）＝4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值－（5～10℃） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。一般为30～60s。 延伸温度与时间： A.延伸温度：一般选在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间： 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min；3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增，但是对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 B.循环次数：循环次数决定PCR扩增程度，主要取决于模板DNA的浓度，一般选在30～40次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 PCR的结果分析 目的基因star PCR扩增产物的片段长度大小为187bp,电泳的条 带也在187bp左右，表明扩增产物是我们的目的条带，并且没有 非特异性条带，无引物二聚体。 PCR常见问题与对策 PCR反应的关键环节有： ①模板核酸的制备 ②引物的质量与特异性 ③酶的质量及纯度 ④PCR循环条件 寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 问题一： 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。 Mg2+浓度: Mg2+浓度过低影响PCR扩增产量甚至 PCR扩增失败而不出扩增条带 变性：退火温度太高，延伸时间太短 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 问题二：无扩增产物 现象：对照有条带，而样品无 原因: 1、模板:含有抑制物，含量低 2、Buffer对样品不合适 3、引物设计不当或者发生降解