菌种选育理论及技术.ppt

2、次级代谢产物(主要是抗生素)高产菌株的筛选 利用营养缺陷型筛选 筛选负变株或零变株的回复突变株 筛选去磷酸盐调节突变株 筛选去碳源分解代谢调节突变株 筛选氨基酸结构类似物抗性突变株 筛选二价金属离子抗性突变株 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 筛选自身所产的抗生素抗性突变株 （三）理性化筛选的方法 1、抗性筛选 抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有10–6频率的突变体存在，就容易筛选出来 抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段 （1）一次性筛选法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株 （2）阶梯性筛选法 无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物 药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的 梯度平板法 纸片扩散法 梯度平板法(Gradient plate) 阶梯性筛选法的缺点 ?阶梯性筛选法只有在抑制区域才能挑选抗性菌，而低浓度区域面积较大，优良的抗性突变株若被分散在低浓度区域或远离纸片的区域，则可能没有被检出，因此，漏检的几率较大。 2、营养缺陷型突变株筛选 营养缺陷型突变株的筛选方法 1)淘汰野生型 抗生素法： 将诱变处理液在MM中培养短时让野生型处于活化阶段，而缺陷型处于休眠状态 且在培养基中加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型 菌丝过滤法： 对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而保留在处理液中 2)检出缺陷型 原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长 也称任意法 用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况 此法结果明确，但工作量大 先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型 此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易 3)营养缺陷型生长谱的确定 方法二 以不同组合的营养混合物与融化凉至50℃的MM培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子 在5～6个平皿上可测20株菌以上。 吡哆醇与代谢拮抗物异烟肼的分子结构 梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛选，以提高相应代谢产物的产量。 如：吡哆醇高产菌株筛选 ? 纸片扩散法与梯度平板法的原理类似，用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。 纸片扩散法 与筛选营养缺陷型有关的三类培养基 ①基本培养基（MM，minimal medium）：能满足某一菌种的野生型或原养型菌株营养要求的最低成分的合成培养基 ②补充培养基（SM，supplemental medium）：在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要（其他营养缺陷型仍不能生长）的培养基 ③完全培养基（CM，complete medium）：可满足该菌各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基 具体方法：影印法、点种法、夹层法 点种法 夹层法 第三节 杂交育种 杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合(或接合)使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。 杂交育种的目的在于： （1）通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株(重组体)； （2）可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷； （3）通过杂交，可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种； （4）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗传学理论的发展。 霉菌的杂交育种 准性生殖(Parasexual reproduction)是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。 ① 选择直接亲本 ② 异核体的形成 ③ 杂合双倍体的形成 ④ 体细胞重组 染色体交换 、染色体单倍化 第四节 原生质体技术育种 一、原生质体制备 1．菌体的预处理 （甘氨酸、EDTA、青霉素等） 2．菌体的培养时间 （对数期、对数期到平稳期） 3．酶浓度 4．酶解温度和pH 5．酶解时间(20-40℃) 6．渗透压稳定剂 二、原生质体融合