第十四章基因工程制药工艺.pptVIP

（4）PCR扩增反应体系组成 50mL 总体积 稀释 27～33mL H2O 含目标基因序列 5～10mL 模板DNA 辅酶 1mL 1～5mmol/L MgCl2 催化，热稳定 1～2mL 1～5U/mL DNA聚合酶 扩增的终止点 2.5mL 20mmol/L 反向引物 扩增的起始点 2.5mL 20mmol/L 正向引物 反应的底物 1mL 20mmol/L dNTPs 提供反应环境 5mL 10× 缓冲液 作用 用量 浓度 成分 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 （5）PCR扩增产物 94℃，1min 94℃，30s 94℃，5min 变性 1 94℃，7-10min 55℃，30s 第三个反应 30-35 72℃，1min 55℃，30s 第二个反应 1 第一个反应 循环数 聚合 退火 反应 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 概念：在特异位点上催化dsDNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。 酶切体系组成：目标和质粒DNA，缓冲液，限制性内切酶。 反应条件：适宜温度(37℃)，1小时以上。 终止反应：加热；加入EDTA，螯合镁离子。 电泳检查：酶切完全性。 2、酶切反应 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 粘性末端 平头末端 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 3、连接反应 概念： DNA 双链上相邻的3′-羟基和5′-磷酸基因共价结合形成3′-5′-磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。 连接体系：载体片段与基因片段，缓冲液，连接酶。 连接反应：16℃-26℃，数小时，或过夜。 终止反应：在70℃加热10分钟。 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 4、转化 转化：把外源基因导入宿主细胞的过程； 某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA，使其基因型和表型发生相应变化的现象 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 大肠杆菌转化——CaCl2法 感受态细胞制备： 将培养液转入离心管中，冰上放置10 分钟，然后于4℃下离心10 分钟。 弃去上清，用预冷的0.05mol/L 的CaCl2 溶液10ml 轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30 分钟后，4℃下，离心10 分钟。 加入连接反应产物：混匀，置冰上30分钟。 热击：42℃，90s； 置冰上，1－2分钟。 扩增培养：加入LB培养基，37℃，45分钟。 涂平板：含有抗生素的LB固体培养基上。 筛选培养：37℃，出现菌落。 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 感受态细胞制备：E.coli经Cacl2处理（0～5℃），使细胞膜通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力。 5、筛选与鉴定 非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞 转化子：导入外源DNA的转化细胞 非重组子：仅含有空载体分子的转化子 重组子：含有重组DNA分子的转化子 目标重组子：含有连接正确的重组分子（目的） 非目标重组子：不含目的基因重组子 转化后的细胞类型 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 （1）筛选方法 抗生素筛选法： 抗生素的抗性基因，氨苄青霉素。 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 （1）筛选方法 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 培养基中含X-gal X-gal: 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 β -半乳糖苷酶可以把培养基中无色的X-gal分解成半乳糖和呈蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝，使菌落成蓝色 抗生素筛选法： 篮白斑筛选法： lacZ基因，重组子白色，非重组子蓝色。 （1）筛选方法 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 若LacZ基因被外源DNA插入而破坏，则不能制造半乳糖苷酶，菌落为无色（白色）。 （2）鉴定方法 菌落PCR：含有目标基因 载体大小：电泳检测 酶切鉴定：目标基因插入及插入方向 测序确证：目标基因的序列准确无误 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 14.2. 3 表达载体构建 表达载体概念： 在质粒载体的基础上，在多克隆位点处插入外源基因表达盒所构成。 外源基因表达盒(操纵子模型)： 目标基因 启动 子 终止 子 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 14.2. 4 工程菌构建 过程： 适宜宿主菌的转化 筛选鉴定，遗传稳定性等 目标： 获得质粒能稳定遗传、基因能高效和定向表达的载 体，确保药物的生物活性。 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 不同菌株表达能力不同 同一菌种的不同转化细胞之间存在表达差异 对宿主菌必须进行筛选 目的：获得表达量最大的菌种 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 工程菌表达筛选与产物鉴定 不同诱导时间下的表达大肠杆菌JM109 在不同诱导时间