第十章-基工程菌发酵.ppt

第十章 基因工程菌的发酵 基因工程是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。 基因工程的核心技术是DNA的重组技术。 除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。 基因工程一般分为4个步骤： 取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”； 将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA； 把重组DNA引人某种细胞； 把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。 工程菌的获得 确定目的产物，找出产该产物的细胞。 将细胞破碎后提纯出全部信使RNA。这些信使中包含了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。 利用基因扩增技术（PCR），找出所需的目的基因。 将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组DNA分子。 将重组后DNA分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的基因的重组(工程)菌。 工程菌具备的条件 发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。 菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。 菌株不是致病株，也不产内毒素。 代谢控制容易进行。 能进行适当的DNA重组，并且稳定，重组的DNA不易脱落。 基因工程菌发酵动力学 基因工程菌发酵设备 基因工程菌的高密度发酵和控制 基因工程菌发酵的后处理技术 基因工程菌的不稳定性及对策 应用案例与分析 基因工程菌发酵动力学 基因工程菌发酵动力学模型分类 基因工程菌培养过程的动力学模型 非离散、非结构模型（均衡生长模型） 假设培养体系是均一的，忽略细胞间的差异和不同时期组成及代谢特性的差异 适于研究细胞群体代谢生长代谢规律 离散非结构模型 培养体系中的细胞被区分成许多不同的状态和功能类型，对培养过程中细胞存在明显差异的系统是适合的。 结构非离散模型 细胞被分散成多个不同功能的部分，各部分相互协调作用，对分析胞内代谢调控有应用价值。 离散结构模型 细胞培养过程的实际情况，模拟单个细胞内的生化反应体系，通过单细胞模型的不同组合建立高层次的离散结构模型 1 基因工程菌 细胞 的生长动力学模型 以对数生长期为例,处于该时期的微生物生长的数学模型如下： 其中 为细胞数量 为培养时间 拜为比生长速率 由上式可以推导出 可用以推算在间歇发酵中f 值随世代数n的变化情况,这在基因工程菌株的发酵中是非常重要的参数,例如,假设从斜面培养到33000L发酵培养需要25代时间,25代后含质粒细胞还占多少,即f25为多少就是一个必需考虑到的问题。分析结果表明f值随p和 的增大而减小。 质粒的行为规律与宿主、质粒本身外界环境等密切相关 工程菌培养过程中会发现质粒丢失现象，严重影响外源基因产物的产量和质量 原 因 分配不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。 质粒保持率 为考察质粒稳定性，在此引入质粒保持率Fn的概念，Fn表示分批培养中细胞分裂n次后，培养液中基因工程细胞数与总细胞数的比值，即 表达效率及质粒拷贝数控制 在工程菌培养过程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。 在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量提高。 质粒行为动力学模型的建立意义 10. 2 基因工程菌发酵设备 机械搅拌发酵罐 气升式发酵罐 利用机械搅拌作用，使空气和搅拌液充分混合，促进氧的溶解和传递，满足微生物生长代谢对溶氧的需求 原理：无菌压缩空气作为液体的提升力，使发酵液上下翻动实现混合和传质传热过程。 优点：无机械搅拌机构最大限度的减少了染菌率，减少了机械剪切力，对长菌丝的各种真菌尤为适宜 气体提升充分的气液混合使氧气的传递利用极大提高，特别适合高粘度培养基和对于溶氧要求高的产品。 3、 基因工程菌的高密度发酵和控制 培养基的选择 培养方式的选择 溶解氧的控制 温度的影响及控制 PH 的影响及控制 基因工程菌的发酵工艺中菌体的增殖和产物的表达均在对数期完成 改进：延长对数期的生长时间、缩短衰亡时间 （1）培养基的选择 发酵特点：工程菌在短时间内迅速分裂增殖，菌体密度迅速升高 培养基影响： 高浓度的碳源、氮源和无机盐造成溶液的渗透压过高，导致细胞脱水，抑制菌体生长，目的产物得率下降