第五章 天然和重组蛋白质结构测定.pptVIP

生物质谱技术 生物大分子三维结构的测定方法 测定生物大分子三维结构的方法分为两大类：（1）应用X射线晶体衍射图谱法（X-ray crystallography）和中子衍射法测定晶体中的蛋白质分子构象；（2）应用核磁共振法（nuclear magnetic resonance，NMR）、园二色性光谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法和氢同位素交换法等测定溶液中的蛋白质构象。 美国蛋白质数据库(PDB)存入的三维结构数据, 至1993年6月为止总共存入1110套(其中,982套蛋白质、酶与病毒,107套DNA、2套RNA、9套tRNA和10套糖类), 而截止目前,已经存入国际蛋白质三维结构数据库的蛋白质、核酸和糖类的三维结构已超过20000套。 X射线晶体衍射分析迄今仍然是蛋白质和核酸空间结构测定的主要方法。以X射线晶体衍射分析为主要手段，加以NMR方法的不断突破，生物大分子三维结构测定在高速发展，1997～1998年间平均每日～2个结构，而当前已达平均每日～9个结构。 X-射线衍射法概述 X-射线衍射法是测定蛋白质晶体结构的极其重要方法。生物大分子X射线晶体学是揭示分子结构与功能的科学。目前还没有一种工具能够用它直接观察到蛋白质内部的原子和基团的排列。虽然电子显微镜接近于看到大分子的轮廓。但是仍然仅限于揭露分子的大小、形状、对称性和聚集状态等。通过X-射线衍射法（X-ray diffraction method）可间接地研究蛋白质晶体的空间结构。对晶体结构的研究将帮助人们从原子的水平上了解物质。 发展历史 1895年，伦琴(Rontgen)发现了X-ray; 1914年布拉格父子用X射线衍射法对氯化钠、氯化钾晶体进行了测定，指出晶体衍射图可以确定晶体内部的原子（或分子）间的距离和排列。因此获诺贝尔奖。 1951年，加利福尼亚理工学院的保利和科里提出，α-构型的多肽链呈螺旋形，通过X射线确定，组成蛋白质的都是L-型氨基酸。 1953年克里克、沃森在X射线衍射资料的基础上，提出了DNA三维结构的模型。获1962年生理或医学诺贝尔奖。 1959年佩鲁茨和肯德鲁对血红蛋白和肌血蛋白进行结构分析，解决了三维空间结构,获1962年诺贝尔化学奖. 1959年有机化学家豪普特曼和卡尔勒建立了测定晶体结构的纯数学理论，特别在研究生物大分子如激素、抗生素、蛋白质及新型药物分子结构方面起到了重要作用。因此获1985年化学奖。 与X射线及晶体衍射有关的部分诺贝尔奖获得者名单 溶 菌 酶 （lysozyme) 溶菌酶存在于鸡蛋清和动物的眼泪中，其生物学功能是催化某些细菌细胞壁的多糖水解，从而溶解细菌的细胞壁。 溶菌酶是第一个用X-射线法阐明其全部结构和功能的酶。是1922年伦敦细菌学家弗莱明(Fleming)首次发现的。 鸡蛋蛋清溶菌酶的氨基酸序列 当一束单色X射线入射到晶体时，由于晶体是由原子规则排列成的晶胞组成，这些规则排列的原子间距离与入射X射线波长有相同数量级，故由不同原子散射的X射线相互干涉，在某些特殊方向上产生强X射线衍射 晶体的衍射图 这种衍射现象貌似晶体中每个原子作为一个新的散射波源，它们各自向空间辐射与入射波同频率的电磁波。 如何在衍射图与晶体结构之间建立起定性和定量的关系？ 晶体结构基本常识 日常所见的许多晶体，如：氯化钠（离子晶体）、金刚石（原子晶体）等，外形都是非常有规则的。无论是那一类晶体，组成晶体的微粒在空间的三个方向上，都是周期性排列的。 晶体的空间结构是由一组为数无限的、相互平行的、情况相同的平面点阵所组成。每一个点阵所构成的单元叫晶胞。知道了晶体的晶胞就等于知道了整个晶体的空间结构。 Protein Structure By X-RayCrystallography Obtain Crystals ;Expose Crystals to X-rays ;Measure intensity of Diffraction; Compute Electron density at every position in the crystal (x,y,z) ;Place poly-peptide chain into electron density. Protein Crystallization and X-ray diffraction X－射线晶体结构测定步骤 蛋白质晶体的培养和挑选 X－射线照射晶体，得到衍射数据 根据晶体性质，分析衍射数据，获得晶体晶胞空间群。 解晶体结构要进一步知道晶胞中原子的分布也就是原子坐标。这就需要结合其他方法，获得衍射点的振幅、相角、电子密度等信息，最终得到晶体结构。 获得好的晶体是结构分析中最关键的一步 晶体内部结构的