博士研究生课程-后基因组学的主要研究技术.ppt

二、什么是RNA干扰 RNA干扰（RNA interference，RNAi）：外源和内源性双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑的现象 三、RNAi的发现 RNAi 是Napoli C D 等在试图向紫色矮牵牛花转导色素合成基因,用以增加其花色时发现的。结果出乎预料,转基因的植株不仅没有新基因的表达,反而自身的色素合成也减弱了,一些转基因的花出现了全白色或部分白色。他们把这种导入的基因未表达和植物本身合成色素基因的失活现象命名为共抑制(co suppression) 。 之后,Ramano 等在向粗糙孢菌( Neuros pora crassa) 中导入合成胡萝卜素的基因时造成失活, 他们称为基因静止( quelling) 。 Guo S 等发现正义RNA 与反义RNA 有相同水平的抑制效应,但未能就此现象给出合理的解释。 Fire A 等在研究反义核苷酸时发现在线虫体内,双链RNA ( double st randed RNA ,dsRNA) 能有效地抑制有互补序列的内源性基因,且抑制效果优于单链反义RNA 。 至此,正式提出了双链RNA 诱导 RNAi 的概念,开启了RNAi 研究的序幕。 四、RNAi可能的反应机制 虽然RNAi 作用的确切机制尚不清楚,但目前普遍认可是Bass 假说。具体概括为三个阶段： 起始阶段：siRNA(small interfering RNA , siRNA)的形成 引发阶段：RISC（RNA induced silencing complex)的形成和效应阶段 循环放大阶段：即RdRP（RNA-depended RNA Polymerase)的扩增阶段 1、起始阶段 在细胞内,双链RNA ( dsRNA)由核酸酶Ⅲ(RNase Ⅲ) Dicer 在ATP 的参与下被处理为21 个～23 个碱基的小RNA ,即小干扰RNA( small interfering RNA , siRNA) 。siRNA 是由19个～21 个碱基配对形成的双链,并在其3′末端有两个游离未配对的核苷酸。 研究发现, siRNA 是RNAi 作用发生的重要中间分子,序列与所作用的靶mRNA 的序列具有高度同源性;双链的两端各有2 ～3 个突出的非配对的3′碱基;两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基。这些是细胞赖以区分真正的siRNA 和其他双链RNA 的结构基础。 研究表明,平末端的siRNA 或失去了5′磷酸基团的siRNA 不具有RNAi 的功能。 2、引发阶段 siRNA 与Argonaute 蛋白家族及其他未知因素结合,形成siRNA-核蛋白复合物(siRNA-ribonucleoprotein complex , siRNP ) 。 siRNP 在ATP 及其他未知因素参与下,使双链siRNA 解旋形成RNA 诱导的沉默复合物(RNA inducing silencing Complex ,RISC) (RISC 可能以完全单链或两条链解旋但不完全分离的形式存在). 继而RISC 在dsRNA 的介导作用下与互补mRNA 结合,并将其降解。 mRNA 被降解在转录后水平,抑制基因表达,因而又称之为转录后基因沉默( post transcriptional gene silencing ,PTGS) 3、循环放大阶段 在siRNA 诱导的RNAi 过程中,可能还存在siRNA 的循环放大过程,以维持它的 RNA 诱导功能。 此过程推测是以siRNA为引物,互补 mRNA 为模板,在 RNA 依赖性 RNA合成酶(RNA-dependent RNA Polymerase ,RdRP) 的作用下,合成新的双链RNA ,再由Dicer作用,产生新的siRNA , 完成siRNA 的放大过程, 开始新的 RNAi 循环。 dsRNA: 外源或内源双链RNA，引起RNAi反应 Dicer酶：RNA酶Ⅲ家族的一员，切割dsRNA siRNA: 即21~23nt的小分子干扰RNA片段，由Dicer酶切割长片段dsRNA而成 RISC: 即RNA诱导的沉默复合物，由双链 siRNA 与核酶复合物结合形成，由此开启RNAi反应的效应阶段 RrpA: 某种特定的蛋白质，与siRNA结合形成RISC mRNA: RNAi作用的靶分子 siRNA的形成 RdRP引导的扩增阶段 RISC的形成 效应阶段：mRNA降解 五、RNAi的特性 (1)“共抑制”性。RNAi 是双链RNA 介导的转录后基因沉默机制,它的启动子相当活跃,外源基因可以转