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贻贝SOD纯化方法的比较 毕业学校：天津师范大学 生命科学学院 姓名: 白超 内容 简介贻贝、超氧化物歧化酶（SOD） 论文摘要 实验目的 实验方法 实验结果 实验技术原理 贻贝 贻贝也称“海红”，“壳菜”，“淡菜”，是我国重要的养殖贝类之一。贻贝肉鲜味美，营养丰富，富含蛋白质，素有“海中鸡蛋” 的美称。 贻贝作为一种优质的海产养殖贝类， 不仅具有很高的食用价值， 而且具有独特的保健功能。但是，随着贻贝养殖产量的迅速增加， 如何充分高效地利用贻贝资源， 开发出更多更好的深加工贻贝产品，既是贻贝产业面临的巨大机遇，也是贻贝产业面临的一个严峻挑战。 超氧化物歧化酶 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,E.C.l.15.l.l,简称SOD)是一类广泛存在于生物体内的金属酶。早在1939年Mann和Keilin就从牛红细胞中分离出这种金属蛋白，并命名为血铜蛋白。直至1969年McCord和Fridovich发现了它的酶活性后，才命名为SOD，并引起了人们的高度重视。 目前人们按金属辅基的不同已发现了四种SOD，分别是Cu/Zn一SoD、Mn一SOD、Fe一SoD和Ni-SOD。 论文摘要 摘要：采用热变性——硫酸铵分级沉淀——并分别采用两种柱层析方法——SephadexG-100；DEAE-SephadexA-50和SephadexG-100两次柱层析的方法从贻贝中分离纯化超氧化物歧化酶。结果表明粗酶液比活力58.91 U/mg；SephadexG-100提纯酶液比活力为555.49 U/mg；DEAE-SephadexA-50提纯酶液比活力为246.61 U/mg；两次柱层析提纯酶液比活力为506.19 U/mg。从提纯酶液的比活力可以看出只经过SephadexG-100的纯化效果优于经过DEAE-SephadexA-50和SephadexG-100柱层析两次柱层析的方法。 实验目的 目前，我国的贻贝产品，多为初加工产品，贻贝活性物质没有得到充分利用。如何采用现代生物技术及食品加工高新技术，开发更多更好的贻贝活性物质新型产品成为目前的重要课题。 SOD广泛存在于动物，植物及微生物体内，近几十年来，SOD的纯化、性质、结构的研究多见于人，哺乳动物，植物酵母等陆地生物的报道，海洋生物尤其是贝类SOD纯化等方面的研究较少。 本实验采用两种纯化方法，即①SephadexG-100②DEAE-SephadexA-50和SephadexG-100进行粗酶液的纯化提取。比较两种方法提纯后的SOD的比活力，酶的纯化倍数。非变性聚丙烯酰胺凝胶检测比较酶的提纯效果。 实验方法 采用热变性，硫酸铵分级沉淀进行粗酶液的提取。 采用两种柱层析方法—SephadexG-100单次柱层析；DEAE-SephadexA-50和SephadexG-100两次柱层析的方法从贻贝中分离纯化超氧化物歧化酶。 实验结果 实验结果 A-50柱层析收集液在280nm（系列1）和酶活力（系列2）图 实验结果 两次柱层析后收集液在280nm（系列1）和酶活力（系列2）图 结论与分析 实验结果 分析 从只经过G-100柱层析的收集液与经过两次柱层析收集液的比活力的比较可以看出，只经过G-100柱层析的收集液的提纯效果要好。可能是因为粗酶液经过A-50柱层析后并未立即进行第二次G-100柱层析，由于经过A-50提纯后的酶液浓度变小，低浓度酶液储存时易于解离、吸附或发生表面变性失效],使得部分酶失活，再经过第二次柱层析酶活力下降。 从贻贝SOD的非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳的NBT活性染色图谱可以看出A-50和粗酶液均共有四条带，G-100和两次柱层析后的酶液均有三条带。因SOD具有抑制NBT光化还原的作用，故说明均属SOD。由于SOD在一定环境下可呈现不同聚合度，不同聚合度的SOD可能带不同电荷，所以SOD经PAGE呈现多条电泳带。另外，SOD结构松驰，无规卷曲较多，易发生构象改变，不同构象分子会呈现不同电泳谱带。 实验技术原理 SOD活性测定方法 酶蛋白活力测定 SephadexG-100柱层析 DEAE-SephadexA-50柱层析 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 * * G-100柱层析收集液在280nm（系列1）和酶活力（系列2）图 8.59 506.19 0.1834 1.6345 两次柱层析 4.17 246.61 0.771 1.9008 A-50 9.43 555.49 0.175 1.9442 G-100 1 58.91 5.56 1.6377 粗酶液 纯化倍数 比活力(u/mg) 蛋白 浓度 (mg/ml) 酶活力 (u) 操作步骤