纳米金的制备与表征[1].pptVIP

实验37 纳米金的制备与表征实验38 纳米金DNA标记及检测 纳米金简介 制备纳米金，主要还是采用还原剂，如柠檬酸钠、硼氢化钠等，还原氯金酸。氯金酸在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金纳米颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称为胶体金。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金。 纳米金标记DNA后可作为纳米金探针进行核酸核算检测。纳米金颗粒随直径的变化会呈现出不同的颜色，此特征可用于核酸杂交检测。纳米金标记DNA用于检测是一种具有很高选择性和灵敏度的新的比色检测多核苷酸的方法，是利用纳米金标记的寡核苷酸探针和靶序列杂交形成伸展的金纳米颗粒—多核苷酸的多聚网络结构，并由此引发粒子光学性质的变化，产生多核苷酸的杂交信号。金纳米粒子在水中形成分散系俗称胶体金，可以与巯基之间形成很强的Au-S共价键这使得胶体金可与含巯基生物活性分子形成探针，可用于多种生物体系的检测中。 比色法进行基因检测的原理 当金颗粒的尺寸降低到纳米量级时，表现出独特的光学和电 学性质。 由于纳米微粒尺寸小，电子能级发生分裂。 能级 之间的间距与粒径大小有关，当能级的间距不同时，具有不 同的等离子共振吸收带，当电子从低能级向高能级跃迁时需 要吸收特定波长的光，导致溶液呈现出不同的颜色。 纳米金 颗粒的尺径越大，吸收谱线越靠近红端。 因此，溶液的颜色 随着粒径的增大而逐渐由红色变成蓝灰色。纳米金粒径与其 等离子吸收峰的关系如图1 所示。而当纳米金粒径分别为 5nm、24.5nm、41nm、71.5nm、 80(含80)nm时，其溶液 外观颜色分别为橙、橙红、红、紫灰、金色。 在正常情况下，纳米金颗粒表面带有负电荷，粒子 之间的静电斥力超过粒子间的范德华力，因此，粒 子之间保持一定的间距，溶液保持稳定状态。 而当 外界条件改变时，例如降低温度，或向其中加入电 解质溶液，均可导致粒子之间发生聚集，从而使其 表面等离子共振吸收带发生红移。 溶液颜色也随着 聚集程度的加强，而逐渐由红色变成蓝色，这就是 采用比色法进行基因检测的基本原理。 纳米金探针的不同检测模式及其在基因检测中的应用 基因检测主要包括基因序列识别和点突变分析 两大内容。 基因序列识别在基因诊断中具有重要意 义。 点突变检测在诊断遗传性疾病、确定癌基因激 活、抑癌基因失活以及与药物抗性相关的突变中发 挥着重要作用。将纳米金探针应用在基因检测 中，不但可以简化实验步骤，还可大大降低检测成 本。 固相检测模式及其应用 Taton等创立了一种将纳米金探针用于识别靶基因的固相检 测模式。 该模式采用预化学处理过的普通玻片或硅片等作为 固相支持物。 在固相支持物上修饰一段与靶基因序列一端互补的寡核苷酸链，我们称 其为捕获探针; 加入待测样品，与支持物上的捕获探针进行杂交; 将未 杂交上的核酸洗去; 加入表面修饰了寡核苷酸链的纳米金(13nm)探针， 该寡核苷酸链序列与靶基因的另一端互补; 纳米金探针与靶基因杂交并 冲洗后，在固相支持物上形成一种由捕获探针、靶基因、纳米金探针三 种成分组成的夹心结构。 最后，在存在靶基因的区域将出现红色斑点。 为了增强检测信号，可以在固相支持物上滴入由坏血酸和硝酸银溶液组 成的银增强液。 由于纳米金颗粒具有催化性，能催化溶液中的Ag+ 还原 成银，被还原出来的银附着在金颗粒的表面形成一层银壳，起到增强信 号的作用。在没有金颗粒的区域，只有极少的银离子存在，从而保证了 银染色的特异性。 信号的强弱与靶基因的量呈正比。 靶基因越多，支 持物表面被固定的纳米金颗粒越多，形成的银壳越厚，检测信号越强。 Taton等将这种检测模式用于单核苷酸多态性分析，具体过 程如下: 针对目的碱基，分别设计四条具有四种不同碱基的 捕获探针; 按上述流程在支持物上形成由捕获探针、靶基因、 纳米金探针三种成分组成的夹心结构。随后，逐渐升高反应 体系的温度，与目的碱基错配的捕获探针先与靶基因发生变 性，经过冲洗后，靶基因与纳米探针均被洗掉; 而与目的碱 基配对的捕获探针仍和靶基因及纳米金探针保持夹心结构， 固定在固相支持物上。 因此，当加入银增强液时，存在错配 碱基的固相支持物上无银壳出现，而配对碱基处可见明显的 银壳。 Taton等的结果显示这种检测模式灵敏度能够达到100pmol/L 等报道了一种基于纳米金标记的拉曼分光 DNA 检测方法， 在这种方法中银作为拉曼表面增强因子沉积在金 颗粒表 面，检测银放大后的光散射，可达到 fmol/L 级的检测灵敏 度。同时，Storhoff等和Alexandre等采用这种检测模式进 行基因检测时，能检测到fmol量级的靶基因，其检测灵敏度 超过了传统的荧光探针。