实验六菠菜叶绿体分离与荧光观察(1).pptVIP

实验六 菠菜叶片叶绿体分离与荧光观察 实验目的 1、了解细胞器分离的一般原理，掌握基本分离方法。 2、观察叶绿体自发荧光与间接荧光 实验原理 细胞器的分离： 先匀浆→差速离心。 将组织匀浆后在等渗介质中差速离心，是分离细胞器的常用方法。 实验原理 用低渗、超声破碎或研磨等匀浆方法可使细胞质膜破损，形成细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器和细胞组分组成的混合匀浆，再通过差速离心，可将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。 实验原理 差速离心：即利用不同的离心速度所产生的不同离心力，分离各种亚细胞组分和各种颗粒。 在一定的离心场中，同一时间内，密度、大小不同的颗粒其沉降速度不同，依次增加离心力和离心时间，密度及大小不同的颗粒会先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 颗粒在离心场中，其沉降速度取决于其大小、形状和密度，也与离心力及介质黏度有关。 实验原理 自发荧光：细胞内含有的某些天然物质，经短波光照射后所发出的光。 诱发荧光：物体经荧光染料染色后，再经短波光照射所发出的荧光。 实验步骤 二、叶绿体的间接荧光观察 取叶绿体悬液１滴于载玻片上，滴加1滴0.01%吖啶橙，染色10min，加盖片，荧光显微镜观察叶绿体的间接荧光。 注意事项： 思考题 P110 第3题： 叶绿体分离实验的原理是什么？ 在分离叶绿体时应注意什么问题？ * * Differential centrifugation 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高尔基体——核蛋白体。 High speed Low speed 实验用品 1．器材 离心机、研钵、天平、显微镜、离心管、纱布、烧杯、量筒、滴管、载玻片、盖玻片 2．材料 新鲜菠菜叶 3．试剂 0.35mol/L氯化钠溶液 （等渗介质） 实验步骤 一、叶绿体的分离与观察 1、菠菜及实验用器皿放入0-4℃预冷。 2、取新嫩菠菜叶，洗净擦干、去粗脉，称10g，放入 研钵。 3、加入0.35mol/L氯化钠溶液20ml，快速研磨（30-60s）。 4、将匀浆用4层纱布过滤。 5、将滤液装入2支离心管，经天平上平衡后，放入离心机中，1000r/min离心２min，去上清，沉淀即为叶绿体。 6、加0.35mol/L氯化钠溶液2ml，悬浮沉淀。 7、取叶绿体悬液１滴于载玻片上，加盖片。 8、普通光镜下观察，荧光显微镜下演示叶绿体的直接荧光。 　　　　　注意事项： * * * * *