基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 第 十 四 章教学教材.pptVIP

* 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、 胰岛素原、 脑啡肽、干扰素基因等。 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合P356 * 从基因组DNA文库获取目的基因 (genomic DNA library) 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 目 录 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 * 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 目 录 cDNA文库的特点 ◆代表了取材当时所表达基因的总和，不包括那些未表达的基因。 ◆mRNA分子中不包括内含子及调控序列，所以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。 体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术。 其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件——模板DNA，寡核苷酸引物， dNTPs ,DNA聚合酶，合适的缓冲液系统(Mg2+)和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增 . 聚合酶链式反应 P483（Polymerase Chain Reaction , PCR） 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? PCR技术的工作原理 目 录 DNA变性 复性 延伸 Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 目 录 DNA片段 Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3 Cycle n 理论上可达2n个拷贝 原料（pg） 产物(μg) 体外高效、快速、特异 地扩增DNA片段 g → mg → ug → ng → pg 重组DNA技术基本原理 基本原理 目的基因的获取 重组DNA导入受体菌 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 （三）外源基因与载体的连接P357 粘性末端连接 平端连接 同聚物加尾连接 人工接头连接 （二）克隆载体的选择和构建 粘性末端连接 外源DNA片段与载体用同一种限制性内切酶切割，获得相同的粘性末端，相互互补配对，在DNA连接酶作用下，形成重组DNA分子。 DNA连接酶 “缝合”基因的 “分子针线”。 DNA连接酶的作用过程 点击播放 2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平末端的补齐 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 如将poly（dA）加到双链DNA片段3’ 羟基上，而将poly（dT）加到质粒载体3’ 羟基上，制造出粘性末端，然后通过退火进行粘性末端连接。 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5 3′ A(A)nA A(A)nA3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 目 录 CCGAATTCG GGCTTAAGC