第九章基因工程基因组学.pptVIP

㈤、基因治疗： 利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到有遗传缺陷患者的基因组中?治疗遗传疾病，通常叫做基因治疗(gene therapy)。 方法：利用减毒的病毒DNA作载体(retro virus DNA)?构建重组DNA分子?用病毒包装物包装后形成的减毒病毒感染患者的细胞?将正常基因整合到染色体上。 例如，用漠洛尼氏鼠白血病病毒(MLV)改造而成的retro virus载体，已用于治疗严重综合免疫缺陷(SCID)。 SCID是由于腺苷脱氢酶基因(adenosine deaminase，ADA)突变引起的，患者无任何免疫功能。 方法：将ADA基因导入到MLV retrovirus 载体中?取代该病毒DNA中的三个基因结构(gag、pol、env)?将重组后的病毒去感染T细胞，使ADA基因整合到T细胞的染色体中?实现基因治疗的目的。 2000年法国Fischer用该方法治愈患有SCID遗传病的两个婴儿(8个月和11个月) 。这一工作被认为是20世纪人类基因治疗上的重大突破。 ㈥、DNA芯片(DNA chips) ： 核酸分子杂交的原理和方法+半导体技术结合?发展形成的一门新技术。这一技术可使许多分子杂交反应同时进行。　　　 DNA芯片技术： 在面积不大(如2cm２)的基片表面分成不同小格?有序地点阵排列于一定位置可寻址的核苷酸分子?将待分析核苷酸分子标记(如用荧光)，变性成单链与芯片上序列相同的核苷酸分子杂交?与芯片上序列不同的核酸分子被洗掉?利用高精度的激光扫描仪记录分子已杂交的荧光信号?计算机软件分析。 DNA芯片的基片：玻璃、硅片或尼龙等。 应用领域： 基因多态性检测（如单核苷酸多态性筛选single nucleotidePolymorphisms ，SNPs) ； 基因表达分析（不同细胞和不同组织的RNA群体比较）； 克隆选择及文库筛选（如cDNA文库）； 基因突变检测及遗传病和肿瘤的诊断等。 1.体外通过限制性内切酶的修剪和DNA连接酶的连接； 2.目标DNA分子 + 载体DNA，共价连接； 3.获得重组DNA分子。 DNA的体外重组： 分离与鉴定基因是DNA重组中的关键步骤之一。 分离的基因可用于分析基因序列、结构与表达，又可为基因工程提供目的基因。 ㈠、从基因库中分离基因： 1.构建基因库（library） 基因库是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。 根据克隆核酸序列、来源，基因库可分为： 核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体库等。 ①. 核基因库： 核基因库(genomic library)：将某生物全部基因组DNA 酶切后与载体连接构建而成的。理想的核基因库应能包括全部基因组序列。 构建文库可采用不同的载体： 质粒载体：重组质粒导入感受态细胞，收集所有菌落。 噬菌体或 (柯斯质粒)载体：重组DNA包装进噬菌体， 感染细菌， 收集噬菌斑。 BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)载体：重组人工染色体，导入相应宿主细胞，收集所有细胞，即为基因库。 ②. 染色体基因库： 将基因组的一部分如一条染色体用来构建基因库?可选择特异基因以及分析染色体结构和组织。 果蝇的多线染色体中，对染色体进行微切割，构建染色体区段基因文库。如对X染色体上多线染色体带的分析。 人类基因组项目研究中，利用流动细胞分离(flow cytometry)技术将人类染色体分开，用于构建单个染色体基因库，大大加速了人类基因组作图和分析。 流式细胞分离原理 分离后的染色体进行涂色验证 酵母菌： 利用改良的脉冲电泳方法(pulsed field gel electro -phoresis ,PFGE) ，将酵母菌16根染色体据其分子量大小分开后，用于构建染色体库，在基因组分析中发挥作用。 ③. cDNA库： 以mRNA为模板?经反转录酶合成互补DNA?构建基因库。 真核生物mRNA的5’端具有一段多聚A尾端序列?得到的双链DNA分子经两端补齐后?以带有限制性酶切点的人工接头连接?酶切后与载体(通常是噬菌体)连接?制备cDNA库。 cDNA库与核DNA库不同： cDNA库仅具有细胞或组织内表达基因的mRNA序列?仅包括基因组的部分基因序列。 cDNA库对于研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的。 通常是将cDNA库与核基因库配合使用，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。 2. 筛选基因库： 根据待选基因相关信息 ? 确定筛选方法和条件?从基因库中筛选、分离基因。 多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗体作探针(Probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针 ? 筛选基因库。 筛库过程： 将