抗噬菌体菌株筛选.docVIP

抗噬菌体菌株筛选 噬菌体的分离 取疑似噬菌体感染的生产菌株斜面或平板，用无菌蒸馏水将菌苔洗下，无菌过滤或离心，收集滤液或上清液。 在摇瓶培养基中接种1%生产菌株的孢子或细胞悬浮液，适温下培养24 h，加入1%的上述滤液或56离心上清液，继续培养24 h，无菌离心或过滤，收集上清液或滤液。 取上述上清液或滤液和生产菌株的孢子或细胞悬浮液各0.25ml，混匀后加在生产菌株的平板培养基上，用刮棒涂布均匀，适温下培养48~96h，确认是否生成噬菌斑。 噬菌体的纯化与增殖 将上述平板上长出的噬菌斑用接种针移入生产菌株培养12~24 h的摇瓶培养液中，继续培养24 h左右，无菌过滤或离心收集滤液或上清液。 取上述滤液或上清液和生产菌株的孢子或细胞悬浮液各0.25 ml，混匀后加在生产菌株的平57板培养基上，用刮棒涂布均匀，适温下培养48~96h，确认是否生成噬菌斑。 重复以上两个步骤，使噬菌体达到纯化和增殖的目的。最终所得滤液或上清液作为纯化噬菌体原液置冰箱保存。 噬菌体效价的测定 取6支灭菌并烘干的小试管，分别标注10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，各加入0.9 ml无菌蒸馏水。 在10-1小试管中加入纯化噬菌体原液0.1ml，混匀后取出0.1ml移入10-2小试管中，如此类推，分别获得6个稀释度的噬菌体稀释液。 在5支灭菌并烘干且分别标注10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的小试管中，分别加入0.1 ml上述10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的噬菌体稀释液和0.9 ml生产菌株的孢子或细胞悬浮液，摇匀后再加入50℃的生产菌株琼脂培养基，迅速摇匀后分别倾入标注10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的灭菌培养皿中，凝固后置适温下培养48~96 h，对所形成的噬菌斑计数。 抗噬菌体菌株选育步骤 噬菌体抗性的检测 将上述经过诱变和加热处理的生产菌株孢子或细胞悬浮液0.5 ml涂布到生产菌株的平板培养基上，表面干燥后加入0.1 ml保存的噬菌体原液，涂布均匀后置适温下培养48~72 h，观察噬菌斑的形成并计数(如无噬菌体原液，也可用噬菌斑制成悬浮液)。 将未经诱变但经加热处理的生产菌株孢子或细胞悬浮液按上述步骤操作，观察噬菌斑的形成并计数。 将未经诱变和加热处理的生产菌株孢子或细胞悬浮液按上述步骤操作，观察噬菌斑的形成并计数。 比较三者计数结果，确定噬菌体的加热死亡率和诱变后的抗性率。 盐酸羟胺的后续处理 盐酸羟胺有促进溶原性噬菌体释放的作用，因此可在以上育种步骤中增加盐酸羟胺后续处理一步。 将以上噬菌体抗性检测活性最高的抗性悬浮液分离到含盐酸羟胺0.5%~5%的生产菌株平板分离培养基上，在适温下培养48~96 h至生成单菌落。 将分离的单菌落制成细胞悬浮液，60~80℃下处理5~15min，在不含盐酸羟胺的生产菌株平板分离培养基上进行二次分离。 将二次分离得到的单菌落接种斜面，进行生产能力和抗性检测。 高产抗噬菌体菌株的的筛选 按常规方法对抗性菌株进行摇瓶发酵试验或其他方法生产能力检测，筛选高产菌株。 对所得高产菌株再进行噬菌体抗性检测，合格者保留，不合格者销毁。 筛选应优先选取显性(如形态、色素等)突变明显的菌落，这种菌落对噬菌体的抗性几率较高。 筛选所得高产抗性菌株，应制成冷冻真空干燥管进行保存，这种保存方法在保存过程中不会感染噬菌体。