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CTAB法和磁珠法提取植物DNA的比较研究 ——分子生物学教学实验方法改进探索 韩 霜 （ 洛阳师范学院 生命科学系 河南洛阳 471022 ） 摘要:通过学生实验教学过程，比较研究了CTAB法和磁珠法提取DNA的优劣，得出磁珠法无论从DNA的提取质量、实验过程的安全性和提取时间等方面都大大优于传统的CTAB法。为磁珠法提取植物DNA实验在大、中、小学生的分子生物学、遗传学等实验课教学普及应用方面奠定了一定的基础，从而促进了生物实验教学方法的优化和改革。 1 实验仪器、材料和试剂 主要实验仪器与设备 传统CTAB法：研钵、水浴锅、1.5ml离心管、高速离心机、移液枪、凝胶成像系统等 磁珠法： 漩涡振荡器 磁力架 植物磁珠法DNA试剂盒等 1.2实验材料 CTAB法: 新鲜菠菜叶片 磁珠法：各种植物老叶嫩叶、根茎、种子等，可任选其一(本实验用菠菜叶片)。 1.3 实验试剂 CTAB法: CTABⅠ溶液、CTABⅡ溶液、氯仿∕异戊醇、异丙醇、70％（V/V）乙醇、RNase(10mg/ml)、琼脂糖、50×TAE、溴化乙啶母液 磁珠法：细胞裂解液（Buffer A 、Buffer B）、磁珠结合液、洗涤液、洗脱液、电泳缓冲母液、电泳指示液、花箐类核酸染色液 2 实验步骤 2.1 CTAB法[2] 将300mg菠菜嫩叶加入研钵中快速研磨，研磨的尽量细。 将研磨好的材料加入1.5ml的离心管中，加400μLCTABⅠ,混匀。 加入500μl 65℃预热的CTABⅡ溶液，65℃保温30min,不时颠倒混匀。 冷至室温后加450μl氯仿∕异戊醇（24:1），颠倒混匀使溶液呈乳浊状（不要振荡），以8000r∕min的转速离心5min。 取上清液，加5μl RNase，37℃保温30min。 加600μl预冷的异丙醇，颠倒混匀。 以8000r∕min的转速离心10min，沉淀DNA，弃去上清液。依次用800μl 70％（V/V）乙醇洗涤沉淀两次。 稍干燥，将DNA沉淀溶解于30μl灭菌的双蒸水，4℃保存。 在0.7％（m/V）的琼脂糖凝胶上稳压电泳，检测基因组DNA的情况。 2.2 磁珠法提取DNA 裂解:称取菠菜叶片50mg，撕成小片放入研钵中稍加研磨，加入400ul BufferA，混匀转移至1.5ml EP管中。然后把EP管置于恒温水箱中65℃温育15min。将EP管从温浴设备中取出，10000r离心5min。 结合:从离心后的EP管中小心吸取上清200ul至新的1.5ml EP管，加入振荡混匀的磁珠结合液200ul，点振3～5次混匀，室温下放置5min后（如有分层现象，再稍振荡均匀），进行磁分离，用较细吸头吸弃废液，避免吸掉磁珠。 洗涤:加入400ul洗涤液，轻轻点振混匀，放置10S，然后将EP管放在磁力架30S，进行磁分离，待磁珠吸至管壁后，吸弃废液，再加入400ul洗涤液，洗第二次，彻底吸净管盖及管底的残液，室温下开盖干燥3min。 洗脱:加入100ul洗脱液，缓慢抽吸混匀，65℃水浴10min。每隔2~3min轻摇EP管几下混匀.然后磁分离，小心吸取上清液（即DNA溶液）转移至新的EP管中。 DNA的鉴定:取10ulDNA溶液进行电泳，20min后在紫外观察仪上观察。观察提出的DNA条带。 实验结果分析 植物基因组DNA提取 CTAB法 磁珠法 实验原理 利用DNA、RNA、蛋白质等 在物理和化学性质方面的差异 利用包被磁珠的磁性 和特异吸附核酸的性质 一般步骤 步骤繁琐 裂解、结合、洗涤、洗脱 检材用量 300mg 50mg 所需时间 3-4小时 46分钟 琼脂糖电泳 检测结果 点样孔滞留较多；DNA条带清晰，但拖尾现象严重； 点样孔无或很少有滞留；DNA条带清晰，无拖尾现象； 紫外分光光度计 检测结果 OD260/280在1.7以下； 提取DNA的总量为5.0ug左右 OD260/280在1.7-1.9之间； 提取DNA的总量2.0ug左右；提取得率是前者的2.4倍 方法评价 1 步骤繁琐，耗材多，耗时长，效率低，有违低碳环保理念 简单快速，灵敏度高，耗材少，安全无毒，节能环保，效率高，符合高水准高效率的现代化教育和可持续发展理念，具有时代性和先进性。 2 提取的DNA杂质多，降解严重，不利于进行后续实验操作 提取的DNA纯度高，DNA片段完整，可直接用于后续PCR扩增，保证教材前后实验的连续性。 3 操作难度大，学生兴趣不高 易于操作，极大地提高了学生对生物实验的兴趣。 3.1 两种方法使用范围比较 CTAB法是提取植物基因组DNA的较有效的方法，因为植物细胞内多糖、多酚类物质含量较高不宜去除，而CTAB为强力去垢剂，对