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分子标记及基因芯片技术及应用 第十二章 第一节 分子标记技术和应用 分子标记的概念 分子标记类型 标记系统在应用时的选择 分子标记的应用 一、 分子标记的概念 广义的分子标记（molecular marker）：可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白。包括蛋白质标记和DNA标记（狭义的分子标记）。 蛋白质标记包括动植物蛋白、同工酶及等位酶。 理想的分子标记： 1.高多态性 2.共显性遗传 3.能明确辨别等位基因 4.遍布整个基因组 5.无基因多效性 6.检测手段简单快速 7.成本低廉 8.重复性好 二、分子标记的类型 以分子杂交为核心的分子标记： 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP ） 可变数目串联重复位点（variable number tandem repeat，VNTR） 二、分子标记的类型 以PCR为基础的分子标记： 随机扩增多态DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD） 扩增片段长度多态性（amplified fragment length poly-morphism，AFLP） 简单重复序列多态性（simple sequence repeat，SSR） 单链构型多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP） 二、分子标记的类型 以DNA序列为核心的分子标记： 转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）测序分析技术 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP） 1. RFLP标记 （1）RFLP原理 RFLP：限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism ） RFLP指应用特定的核酸内切酶切割有关的DNA分子所产生的DNA片段在长度上的变化。 细胞内DNA量通常用绝对量（Pg）或碱基对（bp）数目表示，也常用千碱基对（Kb）或万碱基对（Mb）表示。 1Pg=0.965×109bp=6.1×1011dalton=29cM （1） RFLP原理 生物能快速、精确地复制自身的DNA，但这种精确性是相对的。实际上，在植物的自然群体中存在大量的DNA序列变异。如：碱基对的代换、缺失等。几乎不可能有两个生物体DNA的碱基序列是相同的。 限制性内切酶酶解DNA长链，是识别DNA上的特异的位点并在这些位点上切断的过程。酶识别位点碱基对越少，DNA分子中被识别的位点越多，所产生的限制片段越短。 （1） RFLP原理 来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源DNA分子，都会在同样的位点被准确切割。但是在不同物种、不同品种、甚至同一品种的不同的两个个体之间，DNA会发生变异，其中有些变异导致了限制性酶切位点的更动，从而产生了限制片段长度的多态性。 （1）RFLP原理 用限制性酶来酶解植物核DNA会产生数万个片段，其大小变化是连续的，如进行电泳分离，只能看到弥散状的连成一片的电泳结果。然而，各限制片段在凝胶中还是分开的，但不能分辨。 进行Southern印迹转移操作，用特定的探针与滤膜上的DNA杂交，经过放射自显影就能检测到高等植物核DNA的RFLP。 （2） RFLP的方法与步骤 （1）DNA的分离：可用CTAB法或SDS法 （2）酶切：一般根据基因组总DNA的复杂性选用限制酶。 （3）琼脂糖凝胶电泳 （4）Southern印迹转移 （5）DNA杂交及放射自显影 （3）RFLP的优缺点 优点 （1）不受性别、年龄局限，不会受表达的组织、发育阶段或外界环境的不同而受影 （2）标记座位的等位基因间是共显性的，通过杂交后电泳带型可直接区别杂合子和显性纯合子 （3）RFLP标记源于基因组DNA自身变异，在数量上几乎不受限制。 （3）RFLP的优缺点 缺点 （1）DNA需要量大。5~10μg （2）所需一起较多 （3）技术较为复杂 （4）大多数RFLP表现为二态性，杂合率低于50%，所提供的信息量较低 （5）与内切酶选用密切相关 2. RAPD标记 随机扩增多态DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD） 1990年，由美国杜邦公司的科学家Williams推出。 RAPD方法是在PC