详细介绍抗体的分离纯化精编版.pptVIP

2016.12.05 1 抗体的制备、纯化及其应用 12/12/2016 2 抗体的分离和纯化 12/12/2016 抗体的分离纯化 3 无论是将抗体用于研究还是用于检测或临床治疗，均需对抗体进行分离与纯化。 分离：将抗体从其存在的体液或培养液中分离出来并加以初步纯化。 纯化： 提高分离出来的抗体的纯度，并将其中的杂质控制在所需的低水平。对治疗性抗体尤为重要。 12/9/2016 4 一、样品处理 分子类型 产量 特定的污染物 来源：野生型 人类血清 多克隆的IgG ， IgM，IgA，IgD ，IgE IgG8-16mg/ml，IgM0.5-2mg/ml；IgA1-4mg/ml；IgD10-400mg/ml；IgE0.4mg/ml 白蛋白，转运蛋白，a大球蛋白 和其它血清蛋白 杂交瘤细胞悬浮培养物 单克隆 多达1mg 苯酚红，白蛋白，转运蛋白， 牛IgG，a大球蛋白和其它血清蛋 白，或者病毒 无血清的杂交瘤细胞悬 浮培养物 单克隆 1-4mg/ml 白蛋白，转运蛋白，常常取决于 培养基的情况 腹水 单克隆 1-15mg/ml 酯类，白蛋白，转运蛋白，脂蛋 白，内源的IgG和其它的宿主蛋白 蛋清 IgY 3-4mg/ml 酯类，脂蛋白 来源：重组表达 胞外蛋白，表达到上清里面 挂有表达标签的的 抗体，抗体融合蛋 白，Fab，或者其片段 取决于表达系统 宿主来源的蛋白，如大肠杆菌中 的蛋白等，通常污染物较少 胞内表达 取决于表达系统 来自宿主的蛋白，如大肠杆菌或 者噬菌体等 天然和重组型抗体主要污染物来源的总结 12/9/2016 5 在样品纯化前要做的主要工作有： • 除去某些杂质，如脂蛋白或者苯酚红等。 • 除去大量的杂志，如粗品中的含量大的杂蛋白等。 • 更换缓冲液并除盐，把样品换到合适的缓冲液中（PH和盐浓度），并除去没有用处的小分子。 12/9/2016 6 纯化前除去特定的杂质 脂蛋白 脂蛋白和其它含脂物质能够阻塞色谱层析柱，最好能在纯化前除去，腹水通常含有高浓度的脂蛋白。 方法一： 在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋白，沉淀可以通过离心除去。 步骤如下： 1．每毫升样品中加入0.04ml 10%的硫酸右旋葡糖酐和1ml 1M的CaCl2； 2．混合15分钟； 3．10,000g离心10分钟； 4．丢弃沉淀； 5．使用脱盐柱将样品换到适合纯化的缓冲液中； 注意：离心通常能够避免过滤时造成的蛋白非特异性吸附，血清蛋白样品可以通过玻璃绒毛过滤以除去酯类。 12/9/2016 7 步骤如下: 1.加入固体PVP到样品溶液中,至最终浓度为3%(w/v); 2.在4度搅拌4小时;3.17,000g离心;4.丢弃沉淀; 5.使用脱盐柱将样品换到适合纯化的缓冲液中; 方法二: PVP(聚乙烯吡咯烷酮)能产生一个pH值依赖的沉淀效应,PVP在pH=7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球蛋白,但是脂蛋白不能够在低于pH4.0时沉淀。 12/9/2016 8 苯酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂,虽然并不直接的影响纯化,但是苯酚红可能结合到某些纯化介质上,应该尽可能早的被除去。苯酚红能够在pH7时结合在阳离子柱上。 苯酚红 注意 ：使用脱盐柱除去苯酚红,并且把样品转移到合适的缓冲液中以做进一步纯化。 12/9/2016 9 血清、腹水、细胞悬浮物或者细胞裂解物的净化 离心或者过虑是实验室净化样品最常用到的手段，这些方法适用于任何来源的少量样品。 注意：离心或者过虑后马上进行色谱层析纯化。 离心用于除去大多数颗粒物质，如细胞碎片。如果在离心后样品仍然混浊，可以再选用一次5um的滤膜过滤，再用滤膜再次过滤。 注意： 对于少量的样品或者蛋白能吸附在滤膜上，可以用10000×g离心15分钟。 对于细胞样品，可以在40000到50000×g离心15分钟，若样品需要短处理时间，可以减少到10到15分钟。 离心时使用冷冻功能，并且在冷室或者离心机中提前预冷转子。 血清样品可以在离心之后用玻璃绒毛过滤以除去剩余的酯类。 一、离心和过滤 12/9/2016 10 过滤能除去颗粒物质。醋酸纤维素膜和PVDF(聚偏氟乙烯)膜能够有效的减少对蛋白的非特异性吸附。在色谱层析前，依照色谱层析的胶粒大小选择合适的滤膜孔径，这些列在下表中。 滤膜通常的孔径大小 色谱层析柱中柱材的颗粒大小 1um 90um或者更大 0.45um 30或者40um 0.22um 3，10，15um，或者需要更加干净的样品时采用 选择滤孔大小 注意： 用一个预跑来检测目标蛋白的收率，因为有时候样品可能被滤膜表面非特异性吸附。 过滤器可能会饱和——就是滤膜有一个特定的载量，因此在建立一个纯化步骤时，需要考虑这些。 影响离心法的