菌种选育、保藏和复壮.pptVIP

* 常用的菌种纯化方法很多，大体可将它们分为二个层次: 一个层次较粗放，一般只能达到“菌落纯”的水平，从“种”的水平来说是纯的，其方法有划线分离法，涂布分离法和稀释分离法。 划线分离法简便而快速，即用接种针挑取微生物样品在固体培养基表面划线，适当条件下培养后，获得单菌落； 涂布分离法与划线法类似，用涂布棒蘸取培养液，或先将少量培养液滴在固体培养基表面，再用涂布棒在固体培养基表面均匀涂布。 稀释分离法所获得的单菌落更加分散均匀，获得纯种的机率较大。该法是将降至约60℃的固体培养基与少量培养液（事先在培养液中加入无菌的玻璃珠搅拌打散细胞团，再经过滤处理更佳）混匀后，再浇注成平板以获取单菌落。 另一层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法。它可达到细胞纯即“菌株纯”的水平。这种方法的具体操作的方法很多，最简便的方法是利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。如果 遇到不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘疏稀的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管插入菌丝尖端，以获取单细胞。 在具体的工作中，究竟采取哪种方法，应视微生物的实际情况和实验条件而定。 为了提高分离筛选工作的效率，除增殖培养时，应控制增殖条件外，在纯种分离时，也应控制适宜的培养条件，并选用特异的检出方法和筛选方案。 * * 菌种性能测定包括菌株的毒性试验和生产性能测定。若毒性大而且无法排除者应予以淘汰。尽管在菌种纯化中能获得大量的目标菌株，它们都具备一些共性，但只有经过进一步的生产性能测定，才能确定哪些菌株更符合生产要求。 直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。事实上，从自然界直接获得的野生型菌种往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生产。所以，我们常将这些自然界中直接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出发菌株。 * 部分答案 1.培养基成分 (1) 分离培养基和液体产酶培养基． 分离培养基：葡聚糖3 g，NaNO3 0.3 g，K2HPO4 0.1 g，KCl 0.05 g，MgSO4?7H2O 0.05 g，FeSO4?7H2O 0.001g，琼脂2 g，蒸馏水100 mL，自然pH值． 液体产酶培养基：即为分离培养基不加琼脂即得． (2) 初筛培养基：将刚果红配制成4 g/L 的水溶液，每100 mL 分离培养基中加入刚果红溶液1 mL即得． (3) 菌种保存培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基． (4) 菌株鉴定培养基：改良察氏培养基，用葡萄糖替换蔗糖作为碳源． 2.方法 （1）菌种的分离。将土样烘干，并制成1%的悬浮液，涂布到以葡聚糖为惟一碳源的琼脂平板上，于30 ℃培养3～5 d，挑取生长良好的菌落接种于斜面保存并编号． （2）菌种的初筛和复筛。将分离出的菌种点接到初筛培养基平板上，置于30 ℃培养．凡在菌落周围能使刚果红褪色形成透明圈的菌株，接种斜面保存．筛得到的菌株接种到装有50 mL液体产酶培养基的250 mL 三角瓶中，于28 ℃，150 r/min 摇瓶培养5 d．测葡聚糖酶活力，确定产酶活力高的菌株． * 吖啶橙： 3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3 · HCl · ZnCl2, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙AO常与溴化乙啶EB合用双染，因EB只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞.它还可以用作移码突变的诱变剂,能镶嵌于两个相邻的碱基对之间，这样在DNA复制过程中，会使DNA链增加或缺失一个碱基，造成移码突变。吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。 * * 溶磷细菌的平板筛选(5d) * * 青霉菌溶磷实验 高效溶磷的真菌菌株 * * 4.性能鉴定 生产性能测定 通常使用初筛和复筛的方法确定。直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。我们常将这些自然界中直接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出发菌株。 毒性试验 若毒性大而且无法排除者应予以淘汰。 种属鉴定 * * 二、自然选育 自然选育的定义 利用微生物在一