基因工程5重组DNA构建与筛选.pptxVIP

三重组DNA分子构建与筛选一、粘末端DNA片段的连接（一）具有相同粘末端的连接 EcoRIEcoRI对基因酶切HindIII载体酶切HindIIIEcoRI（二）具有不同粘性末端的连接用两种不同的限制性内切酶对载体和外源DNA进行切割后，在它们两端会产生非互补的突出端，经DNA连接酶连接后即产生定向重组体。 HindIII二、平末端DNA片段的连接（一）直接用T4连接酶连接（二）同聚物加尾法优点： 接“尾”后的载体不能自身环化，提高了转化效率。缺点： ① 可能改变目的基因或载体的阅读框，影响外源DNA表达 ② 外源DNA无法收回（三）衔接物连接法衔接物是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。（四） DNA接头连接法 接头的一端是齐平的，而另一端是某种内切酶的粘性末端（五） PCR引入酶切位点防止载体自身环化的措施 1、碱性磷酸酶脱磷酸基法 2、双酶切法 3、过量法： 基因片段：载体（5:1 or 10:1)三、重组DNA连接注意事项第三节 基因转移一、重组DNA导入大肠杆菌 转化、电激法二、重组DNA导入植物细胞的方法 载体介导、基因枪法三、重组DNA导入动物细胞的方法 转染一、重组DNA导入大肠杆菌 （一）转化 将外源DNA分子导入某一宿主细菌细胞的过程都叫转化。 为了有效地使细菌吸收外源的DNA分子，我们通常要