DB53_T 939-2019家畜体细胞系建立与冷冻保存.pdf

ICS 65.020.30 B 40 云 南 省 地 方 标 准 DB53/T 939—2019 家畜体细胞系建立与冷冻保存 2019 - 09 - 23 发布 2019 - 12 - 23 实施 发 布 云南省市场监督管理局 DB53/T 939—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由云南省农业厅提出。 本标准由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。 本标准起草单位：云南省畜牧兽医科学院。 本标准主要起草人：洪琼花、吕春荣、权国波、邵庆勇、吴国权、欧阳依娜、杨红远。 I DB53/T 939—2019 家畜体细胞系建立与冷冻保存 1 范围 本规程规定了家畜体细胞系建立、冷冻保存方法、细胞系命名。 本规程适用于猪、牛、羊、马等家畜体细胞系建立、冷冻保存与细胞系命名。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 原代培养 是指直接从家畜组织或器官，将其分散成细胞后开始的培养。 2.2 细胞系 指原代细胞培养物经首次传代成功后所增殖的细胞群体，可泛指一般可能连续传代的细胞。 3 工作区条件 洁净环境下，无菌操作。 4 体细胞系的建立 4.1 试剂 无钙、镁的磷酸缓冲盐溶液，含有4.00mM L-谷氨酰胺，4500 mg/L葡萄糖的高糖DMEM，胎牛血清， 1%双抗，蛋白酶－乙二胺四乙酸：0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA），二甲基亚砜（DMSO）。 4.2 培养液 高糖DMEM，10%～15%胎牛血清，1%双抗。 4.3 样品采集、保存与运输 4.3.1 采样个体选择 选取系谱清楚、生长发育良好、健康无病的青幼年个体。 4.3.2 采集耳缘组织样本 采集耳缘组织按以下步骤进行： 1 DB53/T 939—2019 a) 先刮净采样部位耳毛，再用碘酒、75%的酒精消毒。 b) 用消毒过的采样工具采取样品。 c) 样品放入 5 mL～10 mL 备有培养基的离心管中，并封口。 d) 标记样品名称、性别、年龄、采样地点、采样部位、个体编号及采样时间等信息，记录表参见 附录 A 中表A.1。 4.3.3 样品保存与运输 样品放入4 ℃的采样箱后应于48 h内带回实验室进行原代培养。 4.4 细胞培养 4.4.1 培养条件 在5% CO2、饱和湿度、37.0 ℃培养箱中进行培养。培养液变黄时应更换培养液，再继续培养。 4.4.2 原代培养 原代培养按以下步骤进行： a) 无菌耳缘组织在75%的酒精中浸泡1 min～2 min，用含1%双抗的PBS反复洗涤3次，每次5 mi