科研基础知识十二讲第四讲-迟毓婧.pdf

核酸基因技术及其应用（二） 中心实验室 迟毓婧 一核酸分子杂交技术及其应用 二基因芯片技术及其应用 核酸分子杂交 核酸分子杂交 （nucleic acid molecular hybridization ） 根据核酸碱基互补配对 原则，用特定已知序列的 DNA或RNA片段作为探针，经 特殊标识后，与提纯或组织 细胞中的靶核苷酸进行杂交， 再经显影或显色的方法，将 结合的核酸序列的位置或大 小显示出来。 核酸分子杂交分类 核酸与探针的类型：  DNA‐DNA  DNA‐RNA  RNA‐RNA 体系介质： 液相杂交：核糖核酸酶切保护法和RNA 酶保护分析法 固相杂交：Southern blot 、Northern blot 、原位杂交 核酸分子杂交特点及应用 核酸分子杂交特点： 高度的灵敏性(pg) 、高度的特异性 应用： 克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定 基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。目前 核酸分子杂交不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用, 而且在临床基因诊断上的应用也日趋增多。  核酸探针的制备  核酸分子杂交技术  Southern blot  Northern blot  原位杂交 一 核酸探针的制备 （一）探针的概念： • 核酸分子探针（probe）： 是指带有放射性或其它标记物用于检测核 酸样品中特定核苷酸序列的已知序列的单链 寡核苷酸片段。 探针选择最基本的原则是应该具有高度特 异性，一般探针越长，杂交作用越强，其专 一性也越强。 （二）探针的种类 （1）基因组DNA探针 基因组DNA被克隆、扩增和/或纯化后可获得大量高纯 度的DNA以制备探针。 （2 ）cDNA探针 以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的 DNA链。 cDNA探针不含内含子及高度重复序列。 （3 ）RNA探针 以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。具 高杂交效率，但易于降解和标记方法复杂。 （4 ）寡核苷酸探针 可根据基因序列或蛋白质的氨基酸序列推测其编码序 列，人工合成一段寡核苷酸片段。 （三）核酸分子探针的标记 • 理想的探针标记物应具备 ①高度的敏感性 ②标记物与探针结合后，不影响杂交时碱基 配对及探针分子的主要理化性质； ③检测方法除有高灵敏性、高特异性、假阳 性率低外，尚需考虑环境污染少，价格低； ④若用酶促方法标记，应对酶的Km值影响不 大，以保证标记反应的效率和标记产物的 比活性。 （三）核酸分子探针的标记 标记物： 放射性同位素探针 非放射性标记物 （三）核酸分子探针的标记 1. 放射性同位素探针 3 32 35 125 H、 P、 S、 I等 特点：放射自显影技术检测，信号的强弱通过 计数银粒的多少易于进行定量分析。 优点：高特异性，高灵敏度 缺点：存在放射性污染，半衰期短 （三）核酸分子探针的标记 2. 非放射性标记物 常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素 （biotin）、荧光素。 特点： 敏感性不如同位素标记 稳定性和分辨率高 检测时间短 操作简便 不需特殊的防护设备 不存在放射性污染 （三）核酸分子探针的标记 方法： 化学标记法 酶促标记法 （三）核酸分子探针的标记 • （１）化学标记法：标记物直接与核酸进行化学 反应而连接在核酸上，如：光敏生物素标记法等。