常用方法学简介.pptxVIP

研究技术（一）光学显微镜技术（二）电子显微镜技术（三）组织化学术（四）免疫组织化学术（五）原位杂交术（六）细胞和细胞化学定量术（七）组织培养术（八）放射自显影术 问 题 解决方法 观察对象太小 放大显微镜光线不能透过观察对象 切片观察对象缺乏反差 染色观察对象生化成分不同 细胞化学 免疫组织化学观察对象为生活状态 培养（一）光学显微镜技术1、一般光学显微镜2、荧光显微镜3、相差显微镜4、激光扫描共聚焦显微镜（二）电子显微镜技术1、透射电子显微镜2、扫描电子显微镜（三）组织化学术1、多糖2、脂类3、酶4、核酸（四）免疫组织化学术（五）原位杂交术（六）细胞和细胞化学定量术1、显微分光光度测量术2、形态计量术3、流式细胞术（七）组织培养术（八）放射自显影术（一）光学显微镜术light microscope（LM）1 石蜡切片①取材 Formalin 40%, 4%②固定 BouinFormalin 40% 25ml 苦味酸饱和水溶液75ml 冰醋酸5ml ③脱水--乙醇、包埋--石蜡④切片 6um⑤脱蜡 二甲苯→乙醇 →水 ⑥染色 HE Hematoxylin： 核酸RER、 Ribosome Eosin： 蛋白、膜结构（mitochondria、 SER、lysosome）⑦透明、封片3、涂片 血涂片 精液 痰液 培养细胞4、铺片5、磨片 骨和牙需制成磨片、经染色后观察（二）电子显微镜技术 电子显微镜（简称电镜）的发明和使用，使组织胚胎学研究内容发生了深刻变化。光镜分辨率为0.2um，放大倍数约为1000倍，而电镜的分辨率为0.2nm，比光镜高1000倍，可放大几万倍至几十万倍，因此电镜能观察到更微细的结构。在电镜下所见的结构称为超微结构(ultrastructure)。1、透射电镜（transmission electron microscope） 用于观察细胞内部结构，标本制备比光镜的要求更严格，组织块要更新鲜，体积更小（1mm3），固定常用戊二醛和锇酸。切片则用超薄切片机，制成50~80nm的超薄切片，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，然后在电镜下观察并摄片。2、扫描电镜（scanning electron microscope) 用于观察组织或细胞表面的微细结构，标本需经喷镀金属膜特殊处理，然后在扫描电镜下观察，在荧光屏上扫描成像，呈现富于立体感的表面图像，如细胞表面的微绒毛、纤毛和细胞伸出的伪足等。2、冰冻切片 组织置入液氮（-196℃）快速冻结，恒冷切 片机切片、染色。 更好保存细胞内酶的活性、蛋白质结构。 缺点：组织片厚，经冷冻后易破坏组织结构2、荧光显微镜（fluorescence microscope） 由光源、滤光系统和显微镜三个部分组成。光源为高压汞灯，可产生紫外光，标本中的自发荧光物质或经荧光素染色或标记的结构在紫外光激发下可产生各种颜色的荧光，以此来研究该荧光物质在细胞和组织中的分布。3、相差显微镜（phase contrast microscope） 用于进行细胞培养中活细胞的观察，可使无色透明的细胞镜下结构反差明显，图像清晰。4、激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope） 是近年研制和应用的一种新型显微镜。它将激光束落在样品上，并作移动扫描，对样品内某种荧光标记的物质进行二维和三维的动态微量分析测定。可用来研究活细胞内Ca2、 Na+和 K+等pH值的动态变化；细胞内各种细胞器、细胞骨架、核酸、蛋白质和受体等的定位和定量分析；细胞膜电位、膜通道及信息传递的检测；利用激光对细胞结构或染色体作切割、分离和克隆等逐渐成为生物医学研究中重要的研究手段。（三）组织化学术（histochemistry） 应用化学反应与物理反应原理检测组织或细胞内某种化学成分并进行定位、定量及相关功能研究的技术。1、多糖 显示多糖或蛋白多糖的常用方法是过碘酸—雪夫反应(periodic acid Schiff reaction,PAS反应)。组织或细胞中的多糖被结合形成紫红色沉淀物。此反应称PAS阳性反应，PAS阳性部位为多糖存在部位。2、脂类 标本用甲醛固定，冷冻切片，用油红O、尼罗蓝或苏丹类染料染色，使组织和细胞中的脂类物质显示相应颜色。亦可用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。3、酶 酶细胞化学反应的基本原理是利用酶对其相应底物的水解、氧化等作用，使底物的反应产物被某种捕获剂捕获并在原位沉淀，形成有色的终产物，借此测定该酶在细胞内的分布及活性强弱。4、核酸 显示DNA的传统方法是Feulgen反应（F