植物总DNA的CTAB改进提取.docVIP

植物总DNA的CTAB改进提取 一、实验目的 掌握从植物或动物的组织（细胞）中抽提DNA的方法。 二、实验原理 十二烷基肌酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基磺酸钠等去污剂可破坏细胞膜、核膜等膜结构，使蛋白质从细胞内抽提出来。并且在巯基乙醇、EDTA等的帮助下，可是蛋白质变性，，抑制DNAse的活性。而且巯基乙醇还可抑制氧化剂对DNA的作用。加入有机溶剂后，其可抽提蛋白质，使核蛋白与DNA分离，提纯DNA。RNAse可选择性降解RNA，使DNA纯化。醇类可继续洗涤DNA，抽提蛋白，最后可得到较纯的DNA溶液。 三、实验试剂及材料 1、实验材料 李树幼叶 2、实验试剂 a、 DNA提取缓冲液 溶液 I（山梨醇提取缓冲液）：350 mmol/L 山梨醇，100 mmol/L Tris--Hcl，5 mmol/LEDTA； 溶液 II （2%的CTAB提取缓冲液）：200 mmol/L Tris--HCl, 50 mmol/L EDTA,2 mol/L的NaCl ,2%（m/V）的CTAB. 将溶液I和溶液II(在使用前) 按照1:1的比例混合均匀,在混合的时候加入6.25g/L的亚硫酸钠，待亚硫酸钠完全溶解以后即得到DNA提取缓冲液； b、 1 % 巯基乙醇 c、 10 mg/ml RNAse溶液 d、 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1，v/v/v） e、 70 % 乙醇 f、 异丙醇 3、实验器材 台式离心机，研钵和杵，离心管，微量移液器，枪头，恒温水浴锅 四、实验步骤 1.将0.1 g 组织材料于液氮中迅速研磨成粉末，放入离心管中，加入600 uL的抽提缓冲液，再加巯基乙醇10 ul，充分混匀， 2. 取出，降至室温后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1，v/v/v），上下轻缓混合10 min，10000 r/min离心10 min。 3. 取上清，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1，v/v/v），放置2 min，12000 r/min离心5 min。 4. 取上清，加入10 ul RNAse,37 ℃放置20-30 5. 加入2/3体积预冷的异丙醇，于- 20℃放置10 min，12000 r/min离心5 6. 弃上清，加入1 mL 70%乙醇洗涤沉淀。 7. 12000 r/min离心5min，弃上清，将沉淀于超净台上吹干。 8. 加入20-50 ulTE缓冲液或双蒸水。 9. 1%琼脂糖凝胶电泳检测。 五、实验结果及分析 1、电泳检测结果（见下图） 2、结果分析 如上图所示，方框内为我们小组的李树幼叶的总DNA电泳检测结果。因为RNAse已变性的原因，电泳条带前端有许多被破坏的RNA片段。后端（下方）可隐约见一条带，此条带应为提取的李树总DNA。但是，两个样中的条带都不清晰，这是由于DNA量太少的缘故。其原因可能是以下几种情况之一或者不是。a、研磨不充分，溶解出的DNA太少。b、最后无菌水加入太多，样品稀释过度。c、点样量过少，条带不清晰。d、样品未加入凝胶内，因为点样处还残留有亮点。这些只是几种可能，可能不是这些出错，可能是李树幼叶中DNA含量相对较少等。