科研基础知识十二讲第六讲-何湘君.pdf

实时定量PCR检测基因表达 (Real time Quantitative PCR) 北京大学人民医院 何湘君 基因相关疾病 基因结构和功能异常 复 杂 性 疾 病 环境因素所致疾病 多种基因表达改变 （mRNA、蛋白量↑或↓） 基因表达 中间产物 终产物 检测基因表达水平改变 RT-PCR (荧光标记实时定量RT-PCR、 凝胶电泳半定量RT-PCR) mRNA的原位杂交、 Northern Blot 差异显示、 消减杂交、 基因表达谱芯片 免疫组化、 免疫荧光 Western Blot （相对定量或定性） 蛋白双向电泳/质谱 RNA提取的基本原理和方法  由于RNA酶无处不在，且不易灭活，要保证提取 没有降解的全长RNA需要在能够有效抑制RNA酶 的条件下裂解细胞，然后将RNA从各种生物大分 子物质中分离出来。异硫氰酸胍是非常有效的 RNA酶抑制剂，最常用的RNA提取方法是用含异 硫氰酸胍的溶液裂解细胞，再用酚/氯仿抽提分离 RNA （市售产品常将酚混和入异硫氰酸胍裂解液 中）、最后用乙醇（或异丙醇）沉淀得到RNA或 用硅基质材料吸附纯化RNA。 RNA的浓度、纯度检测及完整性鉴定  RNA的浓度可用分光光度计检测， OD260/280应为1.8-2.0，完整无降解的 RNA在凝胶电泳中显示28S RNA 的条带密 度大约是18S RNA的2倍。 RNA提取的注意事项  环境中RNA酶无所不在，稳定性极高，高压不 能灭活；所有试剂和容器须经处理，或添加 RNA酶抑制剂。  细胞内也含RNA酶，所以标本应尽快存-80℃ 以下；提取RNA时要严格遵守裂解液与细胞数 （或组织重量）之间的比例要求，以保证RNA 酶抑制剂对RNA酶的有效抑制。 RNA提取 反转录的原理及应用  反转录是以RNA为模板，在反转录酶催化下合成 互补cDNA链的过程。  反转录引物的种类 Oligo （dT ）、随机引物、或基因序列特异引物  随机引物参与任一种RNA的反转录，Oligo （dT ） 引物只引导mRNA的反转录，基因序列特异引物 只引导该基因序列的反转录。 RT-PCR引物设计的基本要求  一般的引物设计软件都可满足对引物序列碱基组 成和排列的基本要求，但基因组中相当一部分基 因含有与其它基因相似的序列，导致非特异扩增 或定量不准确。另外，基因序列局部的特殊结构 会影响扩增。因此有些情况下需要请专业人士来 设计。  选择引物时要考虑PCR产物的长度，一般来说， 荧光定量PCR要求PCR产物的长度80-150bp。如 果用凝胶电泳方法检测PCR产物，200-300bp的 产物更方便检测。 methods for the quantitation of mRNA northern blotting 需要的RNA量多，操作复杂 一般需要用同位素 RT-PCR 敏感，需要的RNA量少 Northern blot • internal standard should have the same copy number in all cells • does not change significantly in expression when your cells or tissues are su