无菌检查、微生物限度检查方法学验证实例.ppt

无菌检查、微生物限度检查 方法学验证实例 虎杖苷注射液无菌检查的方法验证 样品：虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司 提供，批 培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基， 批号040203；霉菌液体培养基，批号 040302； 营养肉汤培养基，批号 0403045；营养琼脂培养基，批号 040513；0.1%蛋白胨溶液，批号050217；虎红钠琼脂培养基，批号040202；由中检所所培养基室提供。 方法：中国药典2005版无菌检查中薄膜 过滤法方法验证 验证试验用菌种：验证试验用菌种包括金黄色葡萄球菌（26003）、铜绿假单胞菌（10104）、枯草芽孢杆菌（63501）、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌（98001）、黑曲霉菌（98003），来自中国医学细菌保藏中心。 头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证 样品：头孢噻肟钠无菌原料，规格：0.5g/瓶；批号生产单位：Aventis Pharma Deutschland GmbH 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、营养肉汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、虎红琼脂(均由中国药品生物制品检定所培养基室提供) β-内酰胺酶：2ml大于300单位/毫升（批号 表1 细菌数计数 表2 真菌数计数结果 实验结果见表3和表4 表3 细菌实验结果 (20小时观察) 表4 36小时观察真菌结果 表5 实验结果（大肠埃希菌菌数54CFU） 复方磷酸可待因（欧博士止咳露）溶液微生物限度检查法验证实验 样品：复方磷酸可待因（欧博士止咳露），批号309315 、402021，生产厂家为香港欧化药业有限公司。 验证用菌种： 枯草杆菌CMCC（B）63501、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC (F) 98001、 黑曲霉CMCC(F)98003。 方法： 中国药典有关微生物限度检查法方法验证试验。 表1 菌落计数（cfu/ml） 表2 复方磷酸可待因微生物限度检查方法验证 （常规法） 培养基稀释法： 采用加0.5 ml、0.2 ml、0.1 ml /皿供试液，再加15~20 ml琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~48小时观察结果细菌计数，测定回收率。 常规法为1ml供试液加15~20ml菌落计数用培养基；培养基稀释法则为0.5ml供试液加15~20ml菌落计数用培养基为2倍稀释，0.2ml供试液加15~20ml菌落计数用培养基为5倍稀释。 表3 培养基稀释法（1ml加2个平皿）复方磷酸可待因 微生物限度检查验证 具体操作方法 菌液制备： 取经37℃培养18~24h，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml+9ml盐水，10倍稀释至10-5 ~10-7，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。 (2) 取经25 ℃培养18~24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml+9 ml盐水10倍稀释至10-5 ~10-7，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。 取经25 ℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加3~5ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 用标准比浊管比浊，然后取1 ml +9 ml盐水，逐管10倍稀释为10-4，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。 供试液制备： 吸取样品10 ml ，加0.1%蛋白胨水氯化钠稀释液90ml浓度均为1：10供试液，分别人工污染上述5种代表试验菌株。 回收率测定： 试验组: 分别取不同品种的1：10供试液1 ml、50~100个/ ml 试验菌株同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌. (2) 活菌组 测定每一菌株的试验菌数 (3) 供试液对照 测定供试品本底菌数 (4) 稀释剂对照组 结果 菌落计数结果、常规法和培养基稀释法在复方磷酸可待因微生物限度检查法的验证结果见表1、2和表3。 30、27 110、100 73、74 78、 77 153、150 3 54、34 110、120 128、108 45、 23 80、74 2 14、15 110、90 73、72 130、80 94、90 1 大肠埃希菌10-7 黑曲霉10-4 白色念珠菌10-5 枯草杆菌10-5 金葡菌10-5 实验次数 100.0 100.0 100.0 抑菌 抑菌 3 100.0 100.0 100.0 29.4