《沉淀法》-精选课件(公开).pptVIP

一般操作过程 在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂 沉淀物的陈化，促进晶体生长 离心或过滤，收集沉淀物 蛋白质表面特性 蛋白质溶解：相似者相溶 亲水性和疏水性： 有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水蛋白所占的%等。如白蛋白 不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水蛋白所占的%等。如纤维蛋白原。 蛋白质溶液的稳定因素 1)、水化层(hydration shell) tight hydration shell(0.35g water/1g pro) loose hydration shell(2g water /1g pro) 2)、静电排斥 ? zeta电势 Nernst Potential—胶核表面电位(不可测) Stern Potential—(不可测) ? Potential—滑面电位(可测,mobility) 水化层? zeta电势? 静电排斥? Cohn方程式 Cohnx 经验式（用浓度代替离子强度） 用盐析法分离蛋白质的两种方法 Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法； β盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析； 其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。 而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。 无机盐种类 阴离子盐析作用顺序 柠檬酸盐PO43－SO42－CH3COO－Cl－ NO3－SCN－ 阳离子盐析作用顺序（一价） NH4+K+Na＋ 实例 从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3.0)。 工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。 原理 亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加。 水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了溶质分子表面原有水化层的厚度，导致溶质分子脱水凝聚。 特点 有机溶剂沉淀法的优点在于其分辨率高于盐析，加入的有机溶剂易除去，且有机溶剂密度低，利于沉淀物分离。其缺点主要是比盐析更易使蛋白变性，需低温操作。 影响因素 温度 有机溶剂与水混溶时放出相当数量的热量，使体系温度升高，增大了有机溶剂对蛋白变性的影响。 pH值 许多蛋白质在等电点附近有较好的沉淀效果。 较低离子强度的存在有利于沉淀作用，甚至具有保护蛋白质，防止变性，减少水和溶剂相互溶解及稳定介质pH值的作用。稍高的中性盐会使蛋白质产生盐溶。 有机溶剂沉淀实例 * * 生物下游技术 安徽医科大学微生物学教研室 丁晓娟 第四章 提取（初步纯化） 主要任务：提高溶液中的产品的浓度，同时也取出一些杂质，为后道精制工序创造有利条件。 传统的方法：沉淀法、萃取法、吸附法、离子交换； 另外有膜分离、凝胶电泳等。 沉淀法（Precipitation） 沉淀法（Precipitation） 改变溶液条件，使溶解在溶液中的目的物以固体形式分离出的操作技术。分：结晶法与沉淀法。沉淀法是实验室、生产中分离制备生物大分子常用的方法。 利用不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的。 特点：方法简单 成本低 使用广泛 一般作为初步分离的手段 盐析 有机溶剂沉淀 等电点沉淀 非离子多聚物沉淀法 沉淀方法 其他 生成盐复合物方法 亲和沉淀 选择性的变性沉淀 SIS聚合物与亲和沉淀 Tight hydration shell Protein core Loose hydration shell （一）盐析法 (Salting out) 早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。 在蛋白质溶液中加入中性盐后会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，在布朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。 现在常用Cohn经验式来表示蛋白质的溶解度与盐的浓度之间的关系： ㏒S=β－ＫsＩ S——蛋白质的溶解度，g/L; I－一离子强度