AFFYMETRIX基因芯片操作流程.docVIP

PAGE 1 AFFYMETRIX基因芯片操作流程 真核靶片断制备 一 RNA的抽提 哺乳动物细胞或组织RNA的抽提 1.总RNA 使用QIAGEN’s RNeasy Total RNA Isolation kit成功抽提哺乳动物细胞总RNA. 哺乳动物组织作为RNA的来源，建议使用TRIzol抽提总RNA. 2.Poly(A)+mRNA 哺乳动物细胞使用QIAGEN’s Oligotex Direct mRNA kit,从总RNA中抽提mRNA . 哺乳动物组织作为RNA的来源，应首先使用TRIzol纯化，再进行一个Poly(A)+mRNA分离步骤或使用kit. RNA沉淀 总RNA 在用RNeasy Total RNA Isolation kit分离或洗涤后没有必要沉淀总RNA.调整洗脱体积以制备cDNA合成接近希望的RNA浓度。 注：为获得足够量的标记cRNA用来评估和基因芯片表达探针杂交，AFFYMETRIX建议开始合成cDNA的Poly(A)+mRNA最小浓度为0.02μg/μl时的最小量是0.2μg, 总RNA 最小浓度为0.5μg/μl时的最小量是5μg.这样有两个好处： 有足够量在各步检查样品浓度和质量 制备足够的cRNA用于杂交 在TRIzol分离和热酚提取后需要乙醇沉淀；见下面方法. 2. Poly(A)+mRNA 大多数Poly(A)+mRNA分离过程都会导致得到较稀浓的RNA，所以需要在cDNA合成前浓缩mRNA. 3.沉淀步骤： 加1/10体积3M NaOAc,PH5.2,和2.5倍体积乙醇. 混匀，-20℃放置最少1小时. 4℃,≥12000x g离心20分钟. 80%乙醇洗涤沉淀2次. 空气干燥沉淀.继续下面步骤前检查是否干燥. DEPC处理水重新溶解沉淀.最合适的溶解体积由cDNA合成中需要的RNA的浓度和量来决定.先阅读cDNA合成的过程来决定这一步的适合溶解体积. 4.RNA测定 用分光光度计分析RNA浓度，在260nm 1单位吸光度等于40μg/mlRNA. 需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度 A260/A280应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可) 二由纯化的总RNA合成双链cDNA AFFYMETRIX强烈建议HPLC纯化T7-(d7)24 primer 第一链cDNA合成 开始RNA的量:高质量RNA5.0μg -40.0μg 纯化后RNA浓缩由260nm吸光度决定（1单位吸光度=40μg/mlRNA），A260/A280应接近2.0，在1.8-2.1的范围内。建议在检测前跑一个琼酯糖电泳测定RNA质量。rRNA条带应该比较清晰没有明显的托影。 cDNA合成前，DEPC处理水和逆转录的正确体积必须确定。它由加到反应中的RNA浓度和总体积决定。 表1.1 第一链cDNA合成反应逆转录体积 总RNA（μg） SuperScript ⅡRT(μl),200U/μl 5.0-8.0 1.0 8.1-16.0 2.0 16.1-24.0 3.0 24.1-32.0 4.0 32.1-40.0 5.0 RNA 和SuperScript ⅡRT体积不要超过12μl 合成反应应在1.5ML离心管中进行（RNase-free） 表1.2 第一链cDNA合成成分 反应试剂 体积 反应中最后浓度或量 1:Primer Hybridization 70℃放置10分钟 稍微离心，放置冰上 DEPC水 到反应最后体积20μl T7-(d7)24 primer 1μl 100pmol RNA 5.0-40μg 5.0-40μg 2:温度调节 加到相应管子混合均匀 42℃放置2分钟 5×First strand cDNA buffer 4μl 1× 0.1M DTT 2μl 10mM DTT 10mM dNTP mix 1μl 500μM each 3: 第一链合成 加到相应管子混合均匀 42℃放置1小时 SuperScriptⅡRT (200U/μl) 见表1.1 200U-1000U 总体积 20μl 二、第二链cDNA合成 第一链反应放置冰上。稍微离心甩下管壁试剂 在第一链合成的管中加入下列第二链反应试剂（见表1.3） 表1.3 第二链cDNA合成成分 成分 体积 反应中最后浓度或量 DEPC处理水 91μl 5×Second strand cDNA buffer 30μl 1× 10mM dNTP mix 3μl 200μM each 10U/μl E.coli DNA ligase 1μl 10U 10U/μl E.coli DNA polymerase I 4μl 40U 2 U/μl E.coli Rnase H