微生物研究进展chapter4 免疫标记测定技术.pptVIP

免疫球蛋白的结构（Ig、Ab） CH1 VL CL VH CH2 CH3 Hinge Region Carbohydrate Disulfide bond 免疫标记测定技术 免疫标记测定技术 是指用酶、荧光素或放射性同位素等 标记 抗体或抗原后进行的抗原抗体反应。 用于定性、定量或定位检测 标记物的敏感性 + 抗原抗体反应的特异性 酶联免疫吸附分析法 免疫荧光技术 放射免疫测定法 酶联免疫吸附分析法 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA ① 基本原理 ② 关键技术 ③ ELISA的常用方法 ④ ELISA的应用 间接法 双抗体夹心法 竞争法 ① 基本原理 通过酶标记技术，将抗原抗体反应的特异性和酶催化作用的高效性相结合，利用酶反应底物的颜色变化来判断结果。 ② 关键技术： Ⅰ 固相包被技术 Ⅱ 酶交联技术 常用聚苯乙烯微量反应板： Ⅰ 固相包被技术 样品量少 使用方便 重复性好 优点： Ⅱ 酶交联技术 常用的酶：辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酯酶（AP） 交联方法：戊二酸法、过碘酸法 酶 反应底物 显色变化 测定波长/ nm HRP AP 邻苯二胺 邻联甲苯胺 对硝基苯磷酸酯 黄 色 405 桔红色 492 蓝 色 425 ? ③ ELISA的常用方法 Ⅰ 间接法 Ⅱ 双抗体夹心法 Ⅲ 竞争法 （测定抗体） （测定抗原） （定量测定） Ⅰ 间接法（用于测定抗体） 包被 加酶标抗体 洗板 加显色底物 判断结果 加样 洗板 Ⅱ 双抗体夹心法（测定抗原） Sandwich ELISA Add substrate and measure color Antibody coated well Add antigen Add enzyme conjugated secondary antibody Ⅲ 竞争法（定量测定） ? Y Y Y 待测管 E E E Y Y Y E 样品 ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ Y Y Y E ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ 参考管 Y Y Y E E E Y Y Y E E E ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ Y Y Y E E E ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ 酶标抗原 不加样品 底物 ? . 将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性、灵敏性相结合， 特异性：检测准确 灵敏性：微克、纳克水平 一般是塑料制品： 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。 优点：样品量少、使用方便、灵敏度高、重复性好 配套仪器设备的发展使 操作程序规范化和自动化， 操作更标准、结果更可靠，可以用于大量样品的检测！ 画：交联的图！！！！！！ 酶结合部位是Fc段而不是Fab段，这种结合不会影响抗体的活性。 ELISA检测中，用抗原包被塑料反应板之后，必须再用大量的无关蛋白质包被以阻塞可能与免疫血清蛋白的非特异结合的部位，