山东大学本科生科技创新.docVIP

山东大学本科生科技创新 资助课题结题报告 课题名称：烟叶表面微生物的分离与优势种群酶活的测定 研究人员：张金华 徐晓东 张春玉 指导教师：肖敏 资助金额：1500元 累计拨款：750元 起止年月：2004.4——2005.4 2005年5月12日 研究目的和意义 烟叶陈化是卷烟工业的一种初加工方法。在陈化发酵过程中, 烟叶主要化学成分发生变化, 青杂气和刺激性大大减轻, 色泽均匀并加深.因此, 陈化发酵是卷烟工业提高烟叶质量的一个重要环节。目前对烟叶储存陈化技术的研究还比较粗浅。如果能搞清楚陈化机理，采用人工陈化，将能缩短生产周期，提高烟叶品质，带来经济效益。 研究内容 研究烟叶表面微生物的种类及数量变化，研究微生物优势种群的纯化、分离和鉴定，测定优势微生物产生的与烟草陈化相关的酶系，探索微生物在烟草自然陈化过程中的作用。 实验方法 ㈠.间隔一定的时间取自然陈化的烟草样品。 ㈡.取7克样品加入盛有100ml无菌水的三角瓶内，37℃摇床培养30min，进行梯度稀释。取10e0，10e-1，10e-2三个梯度各0.2ml 进行琼脂固体培养基平板涂布，37℃温箱培养24小时。观察菌落状态，并计数。 ㈢.用平板划线的方法进行不同种微生物的分离纯化，对出现频率较高的微生物进行分类鉴定，确定烟草中所含主要微生物的种类。主要是细菌、霉菌、酵母菌和放线菌。 ㈣.得到主要微生物数量在自然陈化过程中的变化曲线，并确定优势种群。 ㈤.研究测定优势种群微生物的酶系，推测酶系在自然陈化过程中的具体作用，找出其最大活性的适宜条件。 ㈥酶的活性测定：取培养18小时的烟叶培养液，培养液1.2ml8000-10000rpm离心1min，取出适量稀释10倍进行酶系测定。测定的酶系有：纤维素酶、CMC酶、半纤维素酶、果胶酶、β-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、苯丙氨酸氨裂解酶、多酚氧化酶。 实验结果 1年来，测定5批样品，分别为2004年3月份、5月份、7月份、9月份和2005年1月份取的样品,依次分别编号为9、10、11、12和13。多种微生物从5批样品中得到分离并计数，并对其分离纯化，保存了菌种。我们还对大部分菌种做了部分的生理生化特性方面的鉴定实验，为菌种的鉴定作了准备。还挑选了其中的优势菌种，测定其酶系。 1．微生物计数及其变化趋势 微生物计数见表1、表2、表3、表4、表5；微生物变化趋势见图1。 表1 2004年3月份所取样品中微生物数量 样品编号 细菌种类 细菌计数（CFU/0.2ml） 1 15 184 2 3 579 3 5 97 4 6 413 5 7 15 6 3 190 7 8 8 8 7 62 10 8 53 11 7 541 表2 2004年5月份所取样品中微生物数量 样品编号 细菌种类 细菌计数（CFU/0.2ml） 霉菌种类 1 12 29 2 8 15 3 9 35 5 4 13 65 5 16 209 1 6 9 57 7 12 103 8 11 93 2 10 13 111 11 18 251 2 表3 2004年7月份所取样品中微生物数量 样品编号 细菌种类 细菌计数（CFU/0.2ml） 霉菌种类 1 9 19 2 9 9 3 7 19 4 18 63 1 5 19 95 6 9 53 7 3 26 8 7 成片 10 18 191 11 10 141 表4 2004年9月份所取样品中微生物数量 样品编号 细菌种类 细菌计数（CFU/0.2ml） 1 8 41 3 13 60 5 10 61 7 2 11 11 9 60 表5 2005年1月份所取样品中微生物数量 样品编号 细菌种类 细菌计数（CFU/0.2ml） 1 7 8 3 9 19 5 5 14 7 5 8 11 11 40 图1 5种烟叶样品细菌变化趋势 2．菌落形态特征及生理生化特性实验结果 3月份样品见表6-11；5月份样品见表12-21；7月份见表22-31；9月份见表32-34；2005年1月份见表35-37； 表6 3月份样品优势微生物形态描述及生理生化特性之一 菌株 编号 菌落描述 菌体 革兰氏染色 芽孢 糖发酵(氧化型+ 还原型-) VP实验 硝酸盐还原 细胞色素氧化酶 过氧化氢酶 柠檬酸实验 备注 9h 24hhh 91-37-1-1 圆形大菌落，淡黄色，中央凸起，边缘不整齐 杆菌 G+ 中生芽孢 + + + _ + + - 91-37-1-2 白色小菌落，圆形，边缘整齐 杆菌 G+ 无芽孢,端生鞭毛 + + + + + + - 91-37-1-3 淡黄色小菌落，圆形发亮，边缘整齐 杆菌 G+ 端生芽孢 + + + _ _ + - 91-37-1