细胞转染实验.pdf

ShineGene Molecular Biotech,Inc. 上海闪晶分子生物科技有限公司 细胞转染实验 一．实验原理 Transfect 上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。 外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法 是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带 质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒 感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病 毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬 时转染方法多采用脂质体法。 利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间 长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率 的提高有巨大的作用。 上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。 Add: Floor 2,Building A,328#, Wuhe Road,Minhang District,Shanghai,201109,China Tel: +86-21 Web: Fax:+86-21 E-mail: master@ ShineGene Molecular Biotech,Inc. 上海闪晶分子生物科技有限公司 二. 实验材料与器材 1）材料 293T 细胞 MyoD 表达质粒和 EGFP 表达质粒 DMEM 培养基 链霉素/青霉素（双抗） FCS（小牛血清） PBS（磷酸盐缓冲溶液） 胰酶/EDTA 消化液 转染试剂（TransFast） 2）器材 20ul/200ul/1ml 微量移液器和 Tip 头 酒精灯 废液缸 血球计数板 涡旋振荡器 恒温水浴箱 台式离心机 35mm 培养皿 转染管 15ml 离心管 观察用倒置显微镜 荧光显微镜和 CCD 三. 实验步骤 细胞传代 (1) 试验准备：200ul/1mlTip 头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架， 微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 (2) 弃掉培养皿中的培养基，用 1ml 的 PBS 溶液洗涤两次。 Add: Floor 2,Building A,328#, Wuhe Road,Minhang District,Shanghai,201109,China Tel: +86-21 Web: Fax:+86-21 E-mail: master@ ShineGene Molecular Biotech,Inc. 上海闪晶分子生物科技有限公司 。 (3) 用Tip头加入 1ml Trypsin 液，消化 1 分钟（37 C，5%CO )。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞 2 完全从壁上脱落下来为止。 (4) 加入 1ml 的含血清培养基终止反应。 (5) 用 Tip 头多次吹吸，使细胞完全分散开。 (6) 将培养液装入离心管中，1000rpm 离心 5min。 6 个细胞加入一个 35mm 培养皿。 (7) 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择 0.8X10 (8) 将合适体积