共聚焦激光扫描显微镜--精选课件(公开).ppt

Intensity Before bleach After bleach 90 min after bleach 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递 细胞膜荧光探针受到极化光线激发后，发射光极性依赖于荧光分子的旋转，这种有序的运动自由度取决于荧光分子周围的膜流动性，所以极性测量能间接反映细胞膜的流动性。细胞膜的流动性在进行膜的磷脂酸组成分析，药物作用点和药物作用效应，测定温度反应和物种比较方面有重要作用。 4 细胞胞间通讯和膜的流动性 5 荧光光漂白恢复（Fluorescence Redistribution After Photo bleaching，FRAP）　　FRAP是用来测定活细胞的动力学参数，借助于高强度脉冲激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光粹灭，该区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度激光扫描探测,因而可得到活细胞的动力学参数。LSCM可以控制光粹灭作用，实时监测分子扩散率和恢复速率，反映细胞结构和活动机制。广泛用于研究细胞骨架构成，核膜结构跨膜大分子迁移率，细胞间通讯等领域。 6 笼锁-解笼锁测定（Caged-Uncaged）　　 这是一种光活化测定功能。生物活性产物或其它化合物处于笼锁状态时，其功能封闭，一旦被特异波长的瞬间光照射后，产生光活化解笼锁，恢复原有的活性和功能，在细胞增殖分化等生物代谢过程中发挥功能。LSCM可以控制笼锁探针的瞬间光分，选取特定的照射时间和波长，从而达到人为控制多种活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。它们包括第二信使、核甘酸、神经介质、钙离子。  7. 荧光能量共振转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer) I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。 供体荧光素 受体荧光素 1.供体与受体间的距离 10nm或=1-7nm 2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠 II.荧光能量共振转移的条件 488nm 520nm 650nm 540nm 650nm 488nm 520nm 供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3) 供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3) FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP Fluorescence Intensity Time 检测 以供体的激发波长的光照射样品,没有共振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现荧光。 应用 ? 受体与配体的相互作用：亚基的结合 与分离 ? 大分子构象的改变 Ligand Cy3 Cy5 III. 常用荧光共振转移探针对 8 粘附细胞分选（Adhered Cell Sort） 　　 采用台扫描方式的LSCM，由于激光束固定在显微镜的光轴上，可对载物台上的样品作精确地定位扫描，从而对所要选择的细胞进行分选，在不改变细胞培养周围环境，细胞铺展程度和生长状态情况下进行细胞分选。 8 粘附细胞分选　　 光刀切割法（Cookie－Cutter）:将细胞贴壁培养在特制培养皿上，利用高能激光在所选细胞周围作八角形切割，只在其间保留所选细胞，选择条件取决于特定荧光和细胞形态学参数，这种分选方法特别适用于选择数量较少的细胞，如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞等。 激光消除法（Laser Ablation）:用高能量激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整的活细胞亚群继续培养，这种方式取决于细胞荧光特性，特别适于对数量较多的细胞选择。 8 粘附细胞分选　　 通过这两种方式可以总体扫描细胞群，进行细胞物理和生化特性的选择。能对百万分之一机率发生突变的细胞作筛选，能不改变细胞类型、形态和活性而克隆细胞，能分离细胞亚群并进行定量荧光检测，能存储细胞位置对特定细胞重复测定。这种细胞分选方式效率和精确度都很高。 借助LSCM我们可以把激光作为光子刀应用，来完成细胞膜瞬间打孔，线粒体、溶酶体和染色体的切割，以及神经元突起切割等显微细胞外科手术。 9 显微手