DNA探针-精选课件(公开).pptVIP

原理 当DNA探针与待测的非标记单链DNA（或RNA）按碱基顺序互补结合时，以氢健将2条单链连接而形成标记DNA-DNA（或标记DNA-RNA）的双链杂交分子。将未配对结合的核苷酸溶解后用检测系统（放射自显影或酶检测等）检测杂交反应结果。 优点 这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。 DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。 DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。 双链DNA探针的合成方法 切口平移法 随机引物合成法 切口平移法 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3羟基末端。同时该酶具有从5→3的核酸外切酶活性,能从切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。 切口平移反应受几种因素的影响 (a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。 (b)DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。 (c) DNA模板中的抑制物如琼